项目十九吞噬细胞功能检测.doc

项目十九吞噬细胞功能检测.doc项目十九吞噬细胞功能检测一、中性粒细胞吞噬功能测定(Neutrophilphagocytosisassay)(一)吞噬试验【实验原理】中性粒细胞具有吞噬功能,当与颗粒物质(如金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌等)混合孵育一定时间后,颗粒物质被否噬。根据吞噬率和舂噬指数可反映该细胞的芬噬功能。【试剂和器材】试剂20%FCSRPMI-1640培养液、、金黄色葡萄球菌培养物、抗凝剂(4g/L柠檬酸钠溶液)。器材37°C温箱、显微镜、滴管、一次性采血针、微量细胞培养板、无苗干棉球、酒精棉球、碘酒棉球、接种环等。【步骤和方法】热灭活葡萄球菌悬液配制取金葡菌24h琼脂斜而培养物,用无菌生理盐水洗下菌苔,用PBS洗涤2次,100°C加热15min灭活。取热灭活金黄色葡萄球曲混悬于20%FCSRPMI-1640培养液中,用比浊法调整浓度至6xl07/mlo4°C保存,备用。于微量细胞培养板孔内加1滴(约50四1)抗凝剂,无菌采人末梢血2滴(约100川)与抗凝剂混匀。向孔内加6x107/ml金黄色葡萄球菌悬液2滴(约100pl),混匀。置37°C烛缸或5%CO2孵箱内培养30min。取1滴培养液推片,自然干燥,Wright染色,水洗,干燥,油镜镜检。【结果判定】天吟玄_200个中性粒细胞中吞噬细菌的中性粒细胞数inno/O曜卒= X1UU/O计数200个中性粒细胞,并分别记下吞噬细菌的细胞数和各个细胞吞入的细菌数。计算吞噬率和吞噬指数:200200会眄少匕粒—200个中性粒细胞吞噬的细菌'总数仓川必寸门双= 【注意事项】所用器材要洁净。越接近片子末梢细胞数越多,计数时应取片子前、中|、后三段计数,以提高准确性。抗凝剂用量要适当,过高则抑制吞噬功能,过低使血液凝固。【方法评价】此法易操作、不需特殊设备,省时,费用低廉。结果直观,可用于评价其他方法获得的结果,但是光学显微镜分辨率低,有时难以计数吞入的细菌颗粒。【临床意义】本试监可用于检测有吞噬功能障碍的病症,如结合NBT试验,在一定程度上可反映机体的免疫功能状态,也可用于有免疫调节活性匆物的筛选。【思考题】简述中性粒细胞吞噬功能测定的原理及临床意义。此法在操作过程中应注意哪些事项?(二)硝基蓝四氮哇(NBT)还原试验【实验原理】细菌感染时,中性粒细胞糖分解代谢活性增强,糖氧化过程中所脱的氢可被吞噬的或渗透到中性粒细胞胞浆内的NBT(nitrobluetetrazolium)染料接受,使淡黄色的NBT还原成蓝黑色的甲(formazan),以折光性很强的点状或斑块状颗粒沉积于中性粒细胞的胞浆内,在光学显微镜下易被识别,借此可以测定中性粒细胞的杀菌功能。NBT还原反应的结构式如下:“N—NFh'n=nh/N-N—-CN=N—R四氮I座基 甲基【试剂和器材】NBT(Sigma产品),%NaCl,用超细玻璃滤器过滤;小量分装,冰冻保存。%沙黄O(safYaninO,Fisher产品)染液取lg沙黄O加入100ml蒸馅水和40ml甘油。。试剂无菌生理盐水、甲醇等。器材37°C温箱、显微镜、载玻片、盖玻片、湿盒、一次性采血针、酒精棉球、无菌干棉球等。【步骤和方法】无