项目十九吞噬细胞功能检测.doc

项目十九 吞噬细胞功能检测
一、中性粒细胞吞噬功能测定
(Neutrophil phagocytosis assay)

(一)吞噬试验
　　【实验原理】
　　中性粒细胞具有吞噬功能，当与颗粒物质(如金黄色葡萄球菌、
　　【临床意义】
此试验为慢性肉芽肿病人检测的筛选试验，这些病人无甲阳性细胞，疾病隐性携带者结果小于正常人。此外，细菌感染(尤其是全身感染)者NBT阳性率可升高。
　　【思考题】
1．简述NBT还原试验的原理。
　　2．NBT还原试验有何临床意义？

二、白细胞杀菌功能测定
(Leukocyte bacterial killing assay)
【实验原理】
将白细胞与细菌、调理素按一定比例混合、培养；短时间作用之后再加入抗生素以杀死胞外细菌，因抗生素不能进入细胞，故吞入胞内的细菌存活；定时取样将白细胞用蒸馏水溶解，释放出细菌，进行培养、计数生长的菌落即可了解中性粒细胞的杀菌功能。
【主要试剂和器材】
1．青霉素-链霉素液 浓度分别为5000U/ml和5000μg/ml，用Hanks液配制。
2．调理素 至少取5个AB血型个体血清，混合后小量分装，置-70℃保存，不要反复冻融。
3．无菌Hanks液、蒸馏水、生理盐水。
4．硅油处理过的无菌试管、离心管、吸管。
5．无菌平皿。
【操作方法】
1．细菌悬液制备
(1)将金黄色葡萄球菌502A接种于肉汤培养基中，置37℃培养过夜。
(2)3000r/min离心10min去上清，并用10ml生理盐水离心洗涤。
(3)用生理盐水调配菌悬液，。
(4)用Hanks液将菌悬液稀释50倍(菌含量约107/ml)，备用。
2．白细胞悬液制备
(1)用含肝素(100U/ml血)的注射器采血10~20ml，置试管中。
(2)加入1/5体积的6％右旋糖酐(分子量200～400kDa)生理盐水溶液，混匀后在37℃直立放置30～60min。
(3)取血浆层，室温1500r/min离心5min，去上清。
(4)用hanks液洗涤，配成浓度为107/ml的细胞悬液。
3．实验操作
(1)混合液制备
①取无菌试管，，，，，混匀。细菌对照管中不加白细胞悬液，用Hanks液代替，其它同实验管，混匀。
②放37℃摇动培养。
③细菌对照管于0时、20min、、3h取样培养计数菌落。实验管于20min、、3h取样培养计数菌落；-链霉素液。
(2)从细菌对照管取样培养计数菌落
①试管中加入水温37℃，加盖，剧烈振摇。
②、，加到两个平皿中，并分别标记1:1000、1:100稀释。
③分别倒入营养琼脂(预先煮沸融化，再57℃水浴平衡)，呈8字形移动平皿轻轻混匀。
④37℃培养48h，计数菌落，在半对