牛凝乳酶原基因的定点突变与酶性质分析.pdf

.�������������:��.����.��
帆�啪㈣���叭叭��摘要�凝乳酶是酸性蛋白酶,它是组成皱胃酶的一种主要成分,在反刍动物的第四胃产生凝乳酶原,主要是水解��业鞍椎腜����D�槊冈谀汤壹庸ぶ杏τ霉惴海�在奶酪生产过程中,它起着凝结牛乳、改善风味的作用。为获得高活性的凝乳酶制剂,本研究通过��际醮涌寺≡豴��.�������上扩增牛凝乳酶原基因,双酶切后定向插入到酵母表达载体���中,构建表达质粒���������,通过电脉冲法将线性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母���中,乳酸克鲁维酵母����攴浅J屎嫌谂D�槊富�虻谋泶铩Mü��%酪蛋白的��平板活性筛选,���ǎ�詈蠡竦昧艘恢甓嗫奖凑�系幕�蚬こ叹鷓�株分泌表达牛凝乳酶原,经��甈��治觯�っ髦刈榕D�槊冈�姆肿恿吭嘉��符合预期大小,酸化处理后为����っ骺梢哉�纷晕壹羟小R禾迮嘌���螅�富�最高达到�.��/�,这为后续的研究提供了基础。该工程菌的获得为进一步优化产酶条件及放大工艺提供了条件,并为凝乳酶的工业化生产奠定了基础。采用定点突变的方法来改变凝乳酶基因的碱基,此方法是依据定点突变试剂盒的方法改良而来,抽提含有凝乳酶基因的质粒载体���.�������逋夂铣赏槐湟�铮�利用高保真������酆厦付灾柿��进行��槐浞从Γ�缓笥肈�,限制性内切酶消化���镆匀コ�0錎�,将消化产物转化大肠杆菌����婊�粞】寺〗�行测序和筛选、鉴定所需突变株。通过��蚘��培养基的筛选,筛选出了五个适合的突变体菌株。我们可以发现,所有的突变体都可以产生凝乳酶,但是突变体所产凝乳酶的活性较重组菌株的酶活性低,这表明此位点的改变可能对凝乳酶的折叠影响较小,但是对催化活性的影响较大。通过结构分析发现本研究所克隆出的凝乳酶为�停�卸系谋曜嘉3墒炷�槊冈��位的氨基酸,�湍�槊冈��位的氨基酸为天冬氨酸,�湍�槊冈��位的氨基酸为甘氨酸。氨基酸位点的改变对�湍�槊傅幕钚杂跋旖洗螅�槐涮錷�����位氨基酸由天冬酰胺变为亮氨酸,��坏淖榘彼岜湮R炝涟彼幔�佣�贾旅富钚缘南陆担��彝�变体����淖钍饰露扔��嫦陆档��妗K得髂�槊傅��位���坏陌被�岬母�变会影响酶的活性和热稳定性,但是对酸碱的敏感性没有改变。��。该菌��甅����
发酵液通过�%乙醇沉淀,�������肿由覆阄龊虳����宋�乩胱咏换徊�析进行分离纯化,纯化后经��甈��缬炯�ㄎ5ヒ坏奶醮��丫�锏降缬敬俊V刈�凝乳酶和突变体所产凝乳酶在��.�上的行为基本一致。重组菌株���的比活力从粗酶液的�����痬�岣咧�������痬��槐涮寰�阭���的比活力从粗酶液的�痬�岣咧���.���谋然盍Υ哟置敢旱�����痬�岣�至������痬��骶�甓既〉昧私虾玫牡拇炕�Ч��通过对酶性质的研究发现,重组菌株���的最适反应温度范围为�.�℃,最适�范围为��.��,其�和��分别是����/�.��突变菌株��的最适�为��,最适温度为��,在此条件下,酶活性能达到最高;其�和��分���鬃钍蕄�胫刈榫�晗嗤��钍�反应温度为��,比正常菌株���和突变体菌株�����奈露扔兴�陆担�銴����分别是���关键词:牛凝乳酶,乳酸克鲁维酵母,定点突变,牛凝乳酶纯化,酶学特性�/�和����别是�����/�和����/�.����.��籰��
琺���������.����【����,������������������.�����������.������,����������������������������,��������甀��猚���瓹�������—���.������������甈���������瓵���甈�������瓵����瑃��.��/����.��瑃�������.�����瓵�������.��������,������.������������.��狿��������畐������.����篈�
琓������琓����.��������琓�����·����������築�������.����������瑀�������������.�����������。�琧��������琄����,�������������甌���瑃��瑂����—�珹���琀��。�����.���狿������,�痬�琺�����一��痬�琣��痬����,������甂��/���,��������瑃��/�.����—��瑃�������.�����������������珽������.����陁�����ぁ����.�
缩写词��������缩略词英文全称��������·�������������������������������������������··�ぁ��