打靶载体构建.doc

利用同源重组技术进行打靶载体的构建
孔冬
小鼠遗传学实验室
南京大学模式动物研究所
基本原理
传统意义上的打靶载体的构建受基因组DNA上限制性内切酶位点的强烈局限。考虑到后期利用Southern杂交进行阳性克隆筛选时的内切酶是否可以区分重组和野生型染色体,同时顾及同源臂两端的内切酶是否能与常用载体的多克隆位点相匹配,最后可供我们进行选择的打靶区域往往非常有限。而近年来发展起来的基于噬菌体的大肠杆菌同源重组系统为我们摆脱这种束缚提供了一个有效的平台。高效、省时、灵活是该系统的三大特点。2004年底小鼠129品系BAC文库末端测序的完成更为这一技术的应用提供了巨大的便利。

大肠杆菌中同源重组的研究由来已久,其原理如图1所示。
图1
而Neal G. Copeland, Nancy A. Jenkins 以及 Donald L. Court实验室所采用的λ噬菌体RED系统较之前代又有以下优势:高效;所需同源序列由500bp 降至45bp;低突变率。为使此系统能便利的应用于条件性基因敲除打靶载体的构建,他们建立了两个大肠杆菌菌株EL250、EL350;三个质粒 pL253、pL451、pL452 (图谱见附录)。两个菌株中的gam 基因以及RED重组酶基因exo和bet均受温度敏感性λ抑制子cI857的严格调控。抑制子在32℃处于活化状态,而其在42℃的短暂失活能使其控制的基因迅速表达。此外,EL250中的Flpe 及EL350中的Cre重组酶基因则受阿拉伯糖诱导的PBAD启动子的调控,在阿拉伯糖的参与下进行表达。这两个菌株可以有效地去除loxP 或 FRT重组位点间的NEO筛选框。质粒 pL253、pL451、pL452均来源于pBlue/Script 载体,分别用于打靶载体的骨架,loxP-FRT-NEO-FRT、或loxP-NEO-loxP片段的PCR扩增。
利用此系统构建条件性打靶载体的基本步骤如图2所示。
自Sanger 研究所定购的129 BAC克隆被装入DH108菌株以琼脂为载体进行邮寄。为使后续操作易于进行,我们首先从100~200 Kb的BAC中将包含左右同源臂的目的片段(约10~20Kb)套取下来(见图3-A)。pL253 载体中的两段同源序列各长500bp,是以129基因组DNA为模板,用PCR的方法获得,经内切酶消化后连接克隆入pL253载体。利用介于两段同源序列之间的线性化位点进行线性化的pL253载体在EL350中与BAC发生同源重组。阳性克隆可用氨苄青霉素筛选获得。
插入loxP位点的原理如图3-B所示。包含两段各长~80bp同源序列的loxP-NEO/Kan-loxP 片段同样以PCR制备,所不同的是该同源序列包含在PCR的引物进行合成。同源重组后的质粒同时具有氨苄青霉素和卡那霉素抗性。重新将质粒抽提物转入EL350中可以去除菌株中其它未发生重组的质粒。加入阿拉伯糖后Cre重组酶的表达可以将loxP位点间的NEO剪切掉,从而只留下一个loxP。同样道理我们可以在EL250中插入第二个loxP。FRT-NEO/Kan-FRT 留在载体中可用于ES细胞的筛选。最终的载体用测序的方法进行验证。
图2
图3
实验技术
以下以基因MLCK(myosin light chain kinase)为例,其载体构建过程如图4E 所示。
129 小鼠品系 BAC 克隆的查询及订购

前往ouse(如箭头所示)。
在Search框内寻找目的基因,例如p53。
在检索结果中选则所要的项。
点击View gene in genomic location后面的链接。
滚动页面到图示位置,点击DAS Source,选择129S7/ clones和BAC ends选项。
点击close menu,等待页面刷新。滚动页面到图示位置,绿色和红色(代表在克隆内不同的方向)的线条都代表包含Trp53的BAC克隆,左边线条下是克隆号。
任选一个克隆比如bMQ358p19,点击克隆号出现下拉菜单,点击DAS LINK: bMQ358p09。
滚动页面到图示位置,点击MTA required(箭头所示处)
9. 从Sanger定购BAC需完成两部分表格:(1)网上电子表格(2)MTA表格,此表格需传真并邮寄原样。
登陆_musculus/ 网站查询目的基因。


BAC 的抽提及纯化

试剂:
Solution I:
Tris-HCl M
EDTA M
pH
Solution II:
SDS 1%
NaOH M
Solution III:
KAc 5 M
pH
步骤:
1. 搜集细菌。90