从大肠杆菌中提取质粒DNA.ppt

从大肠杆菌中提取质粒DNA
生药0911 黄晶
实验流程
实验原理
实验前准备
实验步骤
补充事项
实验流程
大肠杆菌置于LB培养基培养使质粒DNA扩增
收集和裂解细菌
分离和纯化质粒DNA
实验原理
质粒独立于染色体外,且游离于细胞质内或整合在细菌染色体中。
SDS是一种阴离子表面活性剂能使细菌细胞裂解,又能使一些蛋白质变性,释放出质粒DNA和染色体DNA。
实验原理
在碱性溶液中,双链DNA氢键断裂,DNA双螺旋结构破坏而变性,由于质粒DNA分子量相对较小,且呈环状超螺旋结构,在高碱性pH条件下两条互补链不会充分分离,当加入中和缓冲液乙酸钾时变性质粒DNA又恢复到原来的构型;
实验原理
线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物,通过离心沉淀,细胞碎片、染色体DNA及大量蛋白质等可被除去,而质粒DNA留在上清液中。
再用异丙醇沉淀,乙醇洗涤,可以除去残留的蛋白质,得到纯化的质粒DNA。
实验前准备
实验材料:含有质粒DNA的大肠杆菌DH5α
实验仪器:塑料离心管架;10,100,1000μL移液枪;;低温高速离心机一台;无菌工作台;高压锅;玻璃仪器及滴管等。
实验前准备
试剂准备: LB培养基;
;
(含1%SDS);
;
异丙醇溶液及75%乙醇溶液;

实验步骤
将大肠杆菌接种于LB固体培养基,37℃培养 12h, 挑一个菌斑接种在LB液体培养基上,37℃培养 12~16h
。10000r/min离心1min,吸干上清液,加入150 μLGET缓冲溶液,充分混匀,室温放置10min。
实验步骤
GET缓冲溶液中的EDTA可除去细胞壁上的钙离子,使溶菌酶更易与细胞壁接触。
(含1%SDS),加盖,颠倒2~3次,使之混匀,冰浴5min。
SDS可使细胞膜裂解蛋白质变性。