实验十五血清ALT测定(赖氏法).doc

实验十五血清ALT测定(赖氏法)
【目的】
。
2. 掌握血清ALT 活性测定的临床意义。
【原理】
丙氨酸与α-酮戊二酸在丙氨酸氨基转移酶(ALT)的作用下生成丙酮酸和谷氨酸。在反应到达规定时间时,加入2,4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。生成的丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用,生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙。后者在碱性条件下显棕红色。根据颜色的深浅,求得血清中丙氨酸氨基转移酶的活力。反应式如下:
【器材】
试管、刻度吸管、恒温水浴箱、分光光度计。
耗材:血清,座标纸等。
【试剂】
1. 磷酸盐缓冲液()
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4,AR),磷酸二氢钾(KH2PO4,AR),加少量蒸馏水溶解并稀释至1 000ml。
2. ALT底物液
称取α-,,
ml,煮沸溶解后冷却,用1mol/L (), 磷酸盐缓冲液在容量瓶内加至100ml,混匀,加氯仿数滴,置冰箱可保存数周。
3. 丙酮酸标准液(2μmol/ml)
精确称取丙酮酸钠(AR), 。
4. 2,4-二硝基苯肼溶液
称取2,4-,用10mol/L盐酸10 ml溶解后,加蒸馏水至100ml,置棕色瓶内,冰箱保存。
5. NaOH溶液
称取16gNaOH溶于适量蒸馏水中,然后稀释至1 000ml。
【操作】
取2支试管按下表操作:
表3-16 血清ALT测定(赖氏法)操作步骤
加入物(ml)
测定管
对照管
血清


ALT底物液

-
混匀,置37 oC水浴,保温30分钟
2,4-二硝基苯肼


ALT底物液
-

混匀,置37 oC水浴,保温20分钟
NaOH


混匀,静置10分钟,用505nm 波长比色,以蒸馏水调零,读取各管吸光度,用测定管吸光度值减去对照管吸光度值,查标准曲线得ALT活力单位。
【标准曲线绘制】
见下表:
表3-17 血清ALT测定(赖氏法)标准曲线绘制操作步骤
加入物(ml)
管号
0
1
2
3
4
5
丙酮酸标准液(2μmol/ml)
0





ALT底物液













混匀,置37 oC水浴,保温30分钟
2,4-二硝基苯肼






混匀,置37 oC水浴,保温20分钟
NaOH