鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒构建及表达论文.doc

鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒构建及表达论文.doc鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒构建及表达论文
胡权,张正茂,张小勇,张振华,雷延昌,周敦金,黄建国,杨东亮
【摘要】目的构建鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染性克隆,通过体外细胞转染获得单一来源、基因序列清楚的体内实验的感染毒种。方法以湖北麻鸭DHBV分离株(DQ276978)为模板,用PCR法从该DHBV全基因组克隆质粒(pMD-DHBV)和DHBV阳性血清中获取3部分基因片段,总长44kb,克隆至载体PCR21的SacI和NotI酶切位点,构建含15倍鸭乙型肝炎病毒全基因的重组质粒,并酶切鉴定其插入方向。M 2000导入鸡肝癌细胞系(LMH)细胞中转染表达,收集纯化后的转染细胞培养上清液作为体内实验感染的标准毒种。结果 PCR鉴定、(APOBEC3G)真核表达质粒共转染LMH细胞,通过抑制实验以证实该DHBV体外实验模型的初步应用。
1 材料与方法
11 材料
111 质粒 pMD-DHBV为本实验室构建的含有湖北麻鸭(DQ276978)DHBV DNA全长基因组的质粒;pSP65-DHBV16为双拷贝头尾相接的全基因DHBV DNA重组质粒,该克隆质粒(美国 Mandart 教授馈赠);APOBEC3G真核表达质粒为本实验室构建保存;PCR21载体(美国Invitrogen公司)。
112 DHBV阳性血清取自扩增出DHBV DNA全长基因组(DQ276978)的阳性血清。
113 细胞禽类鸡肝癌细胞系LMH,为本室传代保存。
114 工具酶 LA Taq酶、限制性内切酶EcoR I、BamH I、Sac I、Kpn I、Not I及凝胶回收试剂盒(大连 TAKARA公司);Taq DNA聚合酶(美国Promega公司);T4DNA连接酶(美国GIBICO公司)。
115 生化及其它试剂地高辛(DIG)标记及检测试剂盒(德国Roche公司);2000(美国Invitrogen公司)。DNA凝胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒(德国QIAGEN公司);质粒提取试剂盒和动物培养细胞基因组DNA纯化试剂盒(大连TaKR公司)。
12 方法通过对湖北麻鸭(DQ276978)DHBV DNA的全长克隆质粒的序列限制酶切图谱分析〔1〕,已明确其基因组的结构及与复制相关的重要元件的序列位置,在此基础上运用3片法构建出能自我复制的重组质粒。
121 构建质粒PCR 21-DHBV15 用EcoRI和BamHI双酶切pMD-DHBV,得到目的片段DA(DHBV3024/0nt-1473nt);设计引物DB1/DB2和DC1/DC2分别经PCR扩增DHBV阳性血清获得目的片段DB(1473nt-2870nt)和DC(1395-3024/0nt)。将上述3片段插入PCR2
1的相应酶切位点后即得到15倍DHBV全基因重组质粒PCR21-DHBV15。
122 PCR鉴定引物Ps1/Ps2和Pc1/Pc2为DHBV基因S区和C区的高度保守序列段,引物序列如下:Ps1(1318F)5′-TAATCGGATTACTGG-3′,Ps2(1739R)5′-CAGCGTGGCTAATTGAGTTA-3′;Pc1(187F)5′-A-