PDZ1-2结构域与腺病毒穿梭载体重组体的构建.doc

PDZ1-2结构域与腺病毒穿梭载体重组体的构建.docPDZ1/2结构域与腺病毒穿梭载体重组体的构建
:高芳, 胡书群,孙东,张光毅【摘要】目的构建 PSD-95结构域PDZ1/2腺病毒重组体。方法以异硫酸氰胍-酚-氯仿一步法提取的总RNA为模板,采用RT-PCR法获得PDZ1/2的cDNA;与腺病毒穿梭载体用T4 DNA连接酶连接;连接产物转化大肠杆菌JM109进行筛选、序列测定。结果①经RT-PCR得到了PDZ1/2的cDNA;②酶切鉴定能观察到PDZ1/2和pAdTrack-CMV两条带;③ PDZ1/2测序图谱与文献报道完全一致。结论成功构建了含目的基因PDZ1/2的腺病毒穿梭载体重组体。
【关键词】 PDZ1/2;RT-PCR;腺病毒穿梭载体;序列测定

Abstract: Objective To construct rebinant pAdTrack-CMV-PDZ1/2. Methods The total RNA extracted ethod by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction plate, and the cDNA of PDZ1/2 domain plified by RT-PCR; the former ① The cDNA of PDZ1/2 plified by RT-PCR. ② The rebinant contained te digestion. ③ The sequence chromatogram of cloned PDZ1/2 ination

目前,关于缺血性脑卒中神经元损伤和死亡的分子机制主要有3种假说:谷氨酸兴奋毒性、钙超载和自由基。其中,谷氨酸过度激活其受体是缺血性脑卒中脑损伤的关键。

谷氨酸受体(GluR)有离子型谷氨酸受体和代谢型谷氨酸受体[1]。天门冬氨酸受体(NMDAR)和海人藻酸受体(KAR)是离子型谷氨酸受体的重要成员。GluR6是海人藻酸受体的重要组成部分。基于我们以前的研究和实验结果[2-4],我们提出一个新的缺血性脑卒中神经元凋亡的信号通路:谷氨酸→GluR6→PSD-95→MLK→MKK7→JNKs→核依赖的/非核依赖的通路→Caspase 3。

此通路中PSD-95蛋白(postsynaptic density-95)是NMDAR、KAR信号复合体的主要成员。PSD-95家族是膜结合鸟苷酸激酶(membrane-associated guanylate kinase,MAGUK)家族的亚家族。PSD-95家族的结构特征是:氨基端3个PDZ(PSD-95/Dlg/Z0-1)结构域,1个SH3(Src homology 3)结构域和羧基端无活性的鸟苷酸激酶(GK)结构域。这些结构域可分别介导PSD-95家族蛋白质与特异性蛋白质的相互作用[5-7]。如PDZ1/2结构域介导PSD-95与NMDAR2B和GluR6 受体相互作用。

为了证实过表达PDZ1/2能否抑制NMDAR2B和GluR6与PSD-95的结合,本研究以大鼠海马为原料提取总RNA,通过RT-PCR得到其双链cDNA,经酶切回收后,用T4 DNA连接酶将DNA连接到腺病毒穿梭载体上,测序后筛选得到没有发