magcore核酸抽提系统 核酸的酚抽提实验报告.doc

magcore核酸抽提系统核酸的酚抽提实验报告

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陕西师范大学远程教育学院
生物学实验报告

报告题目核酸的酚抽提

姓名刘伟
学号
专业生物科学
批次/层次
指导教师
学习中心


核酸的酚抽提

室温:20°
(一)实验目的:
1、掌握动物组织中核酸提取与鉴定的基本原理及方法
2、通过实验掌握核酸的基本组成
3、熟悉移液枪、离心机、匀浆器的使用
(二)实验原理:
核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA),广泛存在于生物细胞中,本实验从小鼠肝组织分离提取RNA和DNA,在EDTA和SDS等去污剂存在下,用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提,可以得到哺乳动物基因组DNA,用此方法得到的DNA长度为100~150kb,适用于λ噬菌体构建基因组文库和Southern印迹分析。
(三)仪器
离心管、离心机、玻璃棒、滤纸、小烧杯、水域加热炉、10ml试管、沸水浴锅。
(四)准备试剂:
1. 5mol/L NaCl; Tris-Cl,; EDTA,;3mol/L NaAc,pH ;分别进行高压灭菌。
2. 蛋白酶K:10mg/mL,配好后用一次性过滤器过滤,-20
℃保存。
3. 组织匀浆液:100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-Cl(),25mmol/L EDTA()。
4. 酶解液:200mmol/L NaCl,20mmol/L Tris-Cl(),50mmol/L
EDTA(),200μg/mL蛋白酶K,1%SDS。
5. 无DNA酶的RNA酶:将胰RNA酶溶于10mmol/L Tris-Cl()、15mmol/L NaCl溶液中,浓度10mg/mL,于100℃水浴处理15min以破坏DNA酶,缓慢冷却到室温,-20℃保存。
6. TE缓冲液:10mmol/L Tris-Cl(),1mmol/L EDTA()。
7. 平衡酚()∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1(体积比)。
8. 氯仿
∶异戊醇=24∶1(体积比)。
(五)实验步骤
一、制备匀液:
,,在冰浴中用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在,但勿将细胞破碎。
二、分离抽提:
1. ,5000r/m离心30~60s,弃上清。沉淀
,分两管,,缓慢翻转混匀,55℃水浴处理12~18h。
2. 沉淀加RNase至终浓度200μg/mL,37℃水浴1h。
3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇缓慢旋转混匀,冰浴冷却,10000r/m离心10min。含DNA的水相一般在上层,中间为蛋白质沉淀,下层为有机相,但DNA浓度过高时,含DNA的水相会在下层,要注意观察判断。
4. 用扩口吸管移出含DNA的水相,加等体积氯仿/异戊醇,冰浴预冷,10000r/m离心10min,若界面或水相中蛋白含量多,可重复4,5操作。
5. 用扩口吸管小心吸出上层含DNA的水相,加1/10体积的NaAc,小心充分混匀,,-20
℃过液。
6. 12000r/m离心15min,弃上清,75%冷乙醇洗涤一次,12000r/m离心15min,室温干燥(不要太干,否则DNA不易溶解),加入适量TE缓冲液,存放于4℃,轻摇溶解过夜,即可得实验用动物基因组DNA。
(六)注意事项
1、记住离心管编号。
2、在离心管平衡后,对称放入离心机,切忌将没加管套的离心管放入离心机,离心完后取出离心管。
3、避免液体洒在离心机上面或钻头上。
4、启动离心机后,离心机如有不正常反应或噪音,应立即停止离心,并分析原因。
5、各操作步骤要轻柔,尽量减少的人为降解
6、取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰.

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篇二:
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