子生物学实验技术斑马鱼胚胎显微注射实验步骤.doc

斑马鱼胚胎显微注射实验步骤:
显微注射是指在显微镜下操作的微量注射技术。可将细胞的某一部分(如细胞核、细胞质或细胞器)或外源物质(如外源基因、DNA片段、信使核糖核酸、蛋白质等)通过玻璃毛细管拉成的细针,注射到细胞质或细胞核内。是研究各种生物分子的作用、制作转基因动物、克隆动物等的重要技术。显微注射应用的范围非常广泛,从辅助(体外)细胞受精技术至分子和细胞基本组分的转运都需使用这一技术,比较典型的是将某些物质注射进细胞中以操作和/或监测某种特定的存活细胞中的基本机体生物化学状态。这些可以注射进细胞的物质包括有:各种细胞器、激酶、组织化学标志物(比如辣根过氧化物酶或者荧光黄)、蛋白质、代谢物质、微磁头、离子、抗体、基因、分子生物学的mRNA和DNA等等。运用这一技术,也可以实现用于单个细胞或一组细胞的较少量(皮升至毫升)药剂或药物的精确输送(微灌注),例如药理学的药物检验。斑马鱼个体小,养殖成本低,能大规模繁殖,胚胎透明,体外发育,肉眼可见,因此斑马鱼胚胎是很好的开展显微注射的材料。
1、主要试剂的配制
(1) 胚胎培养液的配制
NaCl、 KCl、 Na2HPO4、 KH2PO4、 CaCl2、 MgSO4•7H2O、 NaHCO3、 青霉素、 链霉素加入含有800mL 灭菌水的1L烧杯中,搅拌至完全溶解,再用灭菌水定容至1L。
(2) 显微注射指示剂的配制
,配制成2%的母液。先用1mm滤膜过滤后,,然后储存在-20℃冰箱里备用。
2、显微注射操作
(1) 注射针头的拉制:装上一根直径为1mm的毛细管,拧紧左右两侧的夹子,做好固定,并使其中间部位对准加热丝。设定参数为: Heat-600, Pull-55, Velocity-80, Time-10。然后按开始键,等待毛细管被拉成两个所需的微注射针头。
(2)琼脂糖注射槽的制作:,溶于30ml胚胎培养液中,在微波炉中加热溶解后,先倒入约10ml琼脂糖溶液到6cm的玻璃培养皿中,然后将
注射槽模型轻轻放置于胶面上,再倒入约20ml。琼脂糖凝固后,取出注射槽模型,便形成一个注射槽。每次使用前和使用后都用灭菌水清洗,之后加入少量灭菌水,4℃保存,可反复使用。
(3)显微注射用的胚胎收集:注射前天晚上挑选健康性成熟的斑马鱼按雌雄1:1 的比例放入交配缸中,中间用隔板隔开。饲养水温为28℃,pH值为 ~,光周期为14L:10D。注射当天开灯后,实验准备就绪后将交配缸中的隔板拉开。一般情况下,雌鱼在雄鱼追逐10一20分钟后开始产卵。保证每次收集到的胚胎为一细胞期,用胚胎培养液漂洗数次后即可排布于琼脂糖注射槽中用于显微注射。每次用于显微注射的胚胎数以100枚为基准。
(4)注射体积的确定:打开显微注射仪的电源,打开氮气罐的阀门,调整进气量为60 psi,%酚红的同源或异源核酸分子加到注射针底部。在物镜测微尺上滴一滴矿物油,用显微剪刀呈45度角剪掉尖端,,固定注射气压为 30psi ,在此压力下调节注射时间为 20~80msec (