显微注射斑马鱼胚胎分析基因功能.doc

显微注射斑马鱼胚胎分析基因功能数以百万计的斑马鱼雌鱼是从饲养箱中繁殖出来的,受精卵产在箱的底部并得以收集。收集的鱼卵排列在位于培养皿中的载玻片的一侧, 然后用气体推动注射针中的样品, 并对显微注射设备进行调节使注射量的多少符合要求。最后, 当卵发育至合适的时间时进行显微注射。 1. 简介(略) 2. 鱼卵的收集在注射之前( 前一天) 将鱼放在饲养箱中分开的区域。为使取得卵较多,可按一只雄鱼对两只雌鱼的比例分配。第二天清晨开灯后, 取出饲养箱中的隔板, 使鱼不受干扰地交配大约 20 分钟。用滤网收集饲养箱中的鱼卵, 孵化液( egg water ,注1) 冲洗, 转移到含孵化液的培养皿中。鱼可重新分组入大缸以便再次取卵注射。注意取卵的时间以便获得最大数量的分裂不超过一细胞期的卵。最后,把一片载玻片放在倒扣的 10cm 培养皿盖上,用移液管将鱼卵在载玻片的一侧排成一列,然后用 Kimwipe (注 2 )放在载玻片的另一侧吸去多余的水,然后准备显微注射针。 3. 拉针,加入注射液及相关准备用拉制显微注射针的机器将外径 1mm 的毛细玻璃管拉成两根针,用 15cm 培养皿存放注射针。针可提前拉制好。拉针用以下设置: heat 645, pull 60, velocity 80。用微量加样枪头在针内加入 3uL 注射样品,将加入的样品朝针头方向甩,直至针头内无气泡存在。将针插入显微注射器固定密封好, 检查显微注射的调节设备处于合适的位置, 有较大量程可以调节。将针尖放在显微镜平面上, 使针尖部成像清晰。用镊子断针, 使针尖既可以穿过胚胎的绒毛膜和卵黄, 又能释放大小均一的液滴。我们用往载玻片上的矿物油中注射的方法来确定显微注射液滴的大小。将针头浸入油中, 踩下踏板在油中注射出一个小液滴,根据需要调节注射气压进而调节液滴的大小。在油中注射时,直径 的液滴体积为 500pL (注 3) 。通常注射液滴的体积为 500pL 或 ( 注 4) 。理想的注射量大约是鱼卵体积的 10% , 针尖对注射的质量和结果的一致性都有关键影响。现在开始注射。 , 最好是处于一细胞期。降低注射针, 刺穿胚胎表面的绒毛膜, 平缓的扎入卵黄, 同时注意不要压碎或撕裂卵黄囊, 将样品注入卵黄。注射过程中避免注入气泡, 注意损伤的胚胎。注射时根据需要调整气压以保持液滴大小均匀, 挑出未受精和损伤的胚胎。注射完成后用孵化液轻轻地将鱼卵冲入干净的培养皿, 重复一次。保留一部分未注射的胚胎作为对照。注射第一天晚些时候要挑出死亡