黄芪水提取物对急性骨髓炎大鼠的影响及对ERK-MAPK通路的干预研究.docx

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骨科 甘肃兰州
基金：甘肃省自然科学基金（22JR5RA1065）
【Summary】目的：研究黄芪水提取物对急性骨髓炎（AO）大鼠的影响及对ERK/MAPK通路的干预。方法：随机将大鼠分为正常组、假手术组、模型组、黄芪水提取物组，建立AO模型，造模后给予黄芪水提取物组大鼠黄芪水提取物灌胃治疗21d。Smeltzer评分系统对大鼠胫骨影像学及病理切片HE染色结果打分；血琼脂平板用于培养骨内活菌菌落；ELISA检测骨髓组织液中总一氧化氮合酶（tNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性及一氧化氮（NO）含量；Westernblot和qRT-PCR用于检测胫骨组织中ERK、MAPK蛋白及mRNA相对表达水平。结果：黄芪水提取物组大鼠Smeltzer评分显著低于模型组，骨皮质结构病变减轻，炎性细胞浸润减少；黄芪水提取物治疗后菌落形成数量显著低于模型组；与模型组相比，黄芪水提取物组大鼠脊髓组织液内tNOS、eNOS酶活性降低，NO含量减少，同时ERK1/2、MAPK蛋白
磷酸化增加，ERK、MAPKmRNA表达水平显著升高。结论：杜仲皮水提取物可能通过激活ERK/MAPK信号通路，抑制eNOS酶活性，降低内源性NO含量，从而发挥对AO大鼠的治疗作用。
【Keys】黄芪水提取物；急性骨髓炎；ERK/MAPK
Effects of Huangqi Water Extract on Acute Osteomyelitis Rats and Intervention of ERK/MAPK Pathway
[Abstract] Objective:Study the effect of Huangqi water extract on acute osteomyelitis (AO) rats and its intervention on the ERK/MAPK : Randomly pide rats into normal group, sham operation group, model group, and astragalus water extract group to establish an AO model. After modeling, rats in the astragalus water extract group were treated with astragalus water extract by gavage for 21 days. The Smeltzer scoring system scores the HE staining results of imaging and pathological sections of rat tibia; Blood agar plates are used to cultivate viable bacterial colonies in bone; ELISA was used to detect the activities of total nitric oxide synthase (tNOS), inducible nitric oxide synthase (iNOS), endothelial nitric oxide synthase (eNOS), and nitric oxide (NO) content in bone marrow tissue fluid; Western blot and qRT PCR were used to detect the relative expression levels of ERK, MAPK proteins, and mRNA in tibial :The Smeltzer score of rats in the Huangqi water extract group was significantly lower than that in the model group,
and the structural lesions of the bone cortex were alleviated, with a decrease in inflammatory cell infiltration; The number of colony formation after treatment with Huangqi water extract was significantly lower than that of the model group; Compared with the model group, the activity of tNOS and eNOS enzymes in the spinal cord tissue fluid of rats in the Huangqi water extract group decreased, while the content of NO decreased. At the same time, the phosphorylation of ERK1/2 and MAPK proteins increased, and the expression levels of ERK and MAPK mRNA significantly increased.
Conclusion:The aqueous extract of Eucommia ulmoides bark may exert therapeutic effects on AO rats by activating the ERK/MAPK signaling pathway, inhibiting eNOS enzyme activity, and reducing endogenous NO content.
[Key words]Astragalus membranaceus aqueous extract; Acute osteomyelitis; ERK/MAPK
引言
急性骨髓炎（acuteosteomyelitis，AO）是由化脓性细菌经血行感染引起的骨髓炎症，其感染源多为金黄色葡萄球菌[1]，常由外伤、手术或血液性感染所致脓肿后并发多种炎症反应引起败血症造成关节溃破、骨空洞、骨损伤等病理变化，造成患者终身残疾甚至死亡，严重影响患者的生存质量。近年来，静脉注射细菌敏感性抗菌药物、全身支持疗法或局部治疗等方法的普及显著提高了AO的治疗效果[2]，但总体治愈率仍不理想，临床仍缺少根治AO的有效手段。黄芪
（AstragaliRadix.）又称为黄耆，李时珍释其名曰：“耆，长也，黄音色黄，为补药之长，故名”，现今将“耆”简写为“芪”。现代医学对黄芪的研究发现，黄芪具有明显的抗菌、抗炎作用。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）在炎症反应中起重要作用，ERK介导的级联反应是重要途径，该通路的激活可增加炎症细胞因子的产生，加剧炎症反应。大量研究表明[3]，ERK/MAPK信号通路是黄芪发挥抗炎作用的主要通路之一，ERK/MAPK信号通路在骨髓炎的发生发展中也起着重要作用。而目前尚未见黄芪水提取物在AO发生及治疗中的研究报道，因此本实验拟观察黄芪水提取物对AO模型大鼠的影响，探讨其作用机制。
1材料与方法

总一氧化氮合酶（tNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、一氧化氮（NO）ELISA试剂盒（北京索莱宝公司）；组织蛋白裂解液、BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天公司）；大鼠抗小鼠ERK蛋白（北京义翘神州科技股份有限公司）；兔抗大鼠MAPK蛋白（上海抚生实业有限公司）。


雄性SD大鼠（6月龄，体重260-280g，海南医学院动物实验中心提供）40只，排除先天性畸形、营养不良等疾病。大鼠单笼饲养，标准颗粒饮食，提供饮用水。对照组不做任何处理；实验组CFU金黄色葡萄球菌（ATCC25923菌株，杭州天和微生物有限公司)。水合氯醛麻醉大鼠，行仰卧位固定大鼠，剔除
后肢附近皮肤毛发，消毒；，剥离组织至暴露骨面，钻孔至髓腔，（工作浓度为3×106CFU/ml），骨腊封孔；缝合筋膜、皮肤，全程无菌操作。假手术组大鼠不做钻孔处置，大鼠清醒后观察其生命体征，正常后放回笼中饲养。
/（kg·d）黄芪水提取物灌胃治疗，，假手术组及模型组大鼠给予等量蒸馏水灌胃，每日1次，共给药21d。


观察造模后及给药期间各组大鼠的一般活动情况，直观记录切口部位有无组织液渗出、有无窦道形成以及有无囊肿形成等。最后一次给药结束后3d进行影像学评估，观察胫骨变化，参照Smeltzer评分系统[4]对各组大鼠骨膜反应、骨小梁结构变形、骨干拓宽、新骨形成及软组织结构变形进行打分，总分20分，以各组大鼠平均得分≥10为显著骨髓炎感染。

“影像学评估完成后处死大鼠，沿造模原切口拨出胫骨，剔除软骨组织及肌肉粘连，全程无菌操作。使用咬骨钳（灭菌）将大鼠胫骨捏碎，置于含10mL无菌生理盐水的离心管中，震荡离心，稀释1000倍体积用于菌落计数。取200mL骨组织悬液，接种于血琼脂培养皿，37℃恒温培养24h，观察菌落形成并计数。

胫骨标本浸于中性福尔马林缓冲液中固定，10%EDTA脱钙后嵌入石蜡包埋，纵冠面6mm连续切片，切片行常规HE染色。病理切片平分参照Smeltzer评分系统对胫骨内急性炎症（intraosseousacuteinflammation，IAI）、骨内慢性炎症（intraosseouschronicinflammation，ICI）、骨膜炎症（periostealinflammation，PI）以及骨坏死（bonenecrosis，BN）进行打分，总分16分，以各组大鼠平均得分≥8为显著骨髓炎感染。

收集各组大鼠骨髓组织液，3000r/min离心15min，取上清液，参照TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10检测试剂盒说明书分别检测炎性因子的表达水平

收集各组大鼠骨髓组织液，3000r/min离心15min，取上清液，参照tNOS、iNOS、eNOS、NO试剂盒说明书分别检测各组大鼠组织液在530nm处的吸光值，比较各组大鼠骨髓组织液中相关酶活性和NO含量变化。
-timePCR
根据美国生物技术信息中心（NCBI）公布的大鼠ERK1/2、MAPK基因序列设计两条引物提取各实验组小胶质细胞总RNA，加入M-Mulv逆转录酶进行逆转录反应，设计并合成相应检测基因的引物（序列见后）。采用美国伯乐公司iQ™5Real-TimePCRDetectionSystem并且使用SYBRGreenI的染料进行Real-timePCR检测。每个反应体系为25μl总体积，包含1μlDNA（10ng），×SYBR®Green染料混合液，。其cDNAReal-timePCR反应条件基本为：95℃30s→（95℃15s→60℃30s）
×40repeats→72℃90s，延伸结束后95℃变性30s，再55℃30s，然后从55℃到95℃15s，℃增加一个循环（不同目的基因扩增反应条件略有调整）。每个检测标本设置3个复孔，每个实验重复三次。反应完毕后，记录每个检测样本和β-actin的Ct值。采用iQ5software进行目标基因DNA相对表达量的变化计算，−ddCt（目标基因DNA/β-actin）即表示目标基因DNA的拷贝数。

采用WB检测ERK1/2、MAPK蛋白表达水平，取各组大鼠胫骨组织研碎，加入组织裂解液4℃低温匀浆，充分裂解30min。将裂解产物转移至离心管中4℃12000r·min-1离心收集裂解液上清，经BCA蛋白定量后，按4∶1比例加入4×loadingbuffer煮沸5min。取各组蛋白样本50mg行12%SDS-PAGE恒压电泳，湿转法转移蛋白条带至PVDF膜上，常规抗体孵育后采用凝胶成像仪曝光收集发光图像，以GAPDH为内参蛋白，定量计算各组样品间蛋白相对表达量。

，计数资料以“百分率或构成比%”描述，组间差异的比较采用x2检验或Fisher精确概率法；正态分布的计量资料以“（mean±SD）”描述，两组间差异的比较采用两组独立样本t检验，多组间差异的比较采用方差分析；以P<。
2结果

造模后模型组、黄芪水提取物组大鼠均出现明显切口红肿、脓液渗出等体征变化，少部分大鼠明显可见窦道形成，创面有囊肿分泌形成。杜仲皮水提取物治
疗过程中，治疗1周后，黄芪水提取物组创面分泌物较模型组减少，皮肤颜色红润，且随治疗时间延长出现新鲜肉芽生长；模型组大鼠随时间延长，渗出的血液减少并形成血痂，创面脓包肿大。观察3组大鼠影像学变化并打分，见图1，对照组、假手术组大鼠胫骨组织完整，评分记为0；模型组大鼠可见明显骨质破坏和骨膜反应异常，骨包壳形成，空洞间可见一定程度的骨质增生，评分均值为（±）；与对照组比较，黄芪水提取物组大鼠胫骨影像观察可见骨空洞显著缩小，骨质破坏程度较轻且局部可见新骨形成，评分均值显著降低[（±）vs（±），P＜]。
图1各组大鼠胫骨X射线影像学观察
（A：对照组；B：假手术组；C：模型组；D：黄芪水提取物组）

细菌定量分析结果显示：对照组在无菌操作下无菌落形成，假手术组有轻微菌落计数为（±）×105CFU/mL，模型组大鼠细菌菌落计数为（±）×105CFU/mL，黄芪水提取物组大鼠细菌菌落计数为（±）×105CFU/mL，并经菌种鉴定后确认菌种类别为ATCC25923，黄
芪水提取物组大鼠骨洗液中菌落形成数显著低于模型组，差异具有统计学意义（P＜），见图2。
图2各组大鼠胫骨洗液稀释1000倍体积后细菌菌落生长观察
注：（A：对照组；B：假手术组；C：模型组；D：黄芪水提取物组）

对照组与假手术组大鼠胫骨组织HE染色形态正常，骨皮质结构完整无病理变化。模型组大鼠胫骨组织可见明显异常，骨皮质内髓腔扩大、骨质稀疏，结构破坏严重，并存在大量炎性细胞浸润。黄芪水提取物组大鼠胫骨组织仍可见少量炎性细胞浸润，但与模型组相比黄芪水提取物组大鼠骨髓质病变显著改善，髓腔皱缩，骨皮质结构显著恢复，见图3。
图3各组大鼠胫骨切片HE染色观察病理变化（×100）
、iNOS、eNOS活性检测和NO含量对比
如表1所示，假手术组、模型组、黄芪水提取物组tNOS、iNOS、eNOS、NO水平均高于对照组，假手术组与对照组相比，无统计学差异（
P＞）；模型组、黄芪水提取物组tNOS、iNOS、eNOS、NO水平均高于假手术组，具有统计学差异（P＜）；黄芪水提取物组tNOS、iNOS、eNOS、NO水平均高于模型组，具有统计学差异（P＜）。
表1 各组大鼠骨髓组织液tNOS、iNOS、eNOS活性检测和NO含量对比（）
组别
例数（n）
tNOS（U/mg）
iNOS（U/mg）
eNOS（U/mg）
NO（mol/g）
对照组
10
±
±
±
±
假手术组
10
±
±
±
±
模型组
10
±*
±*
±*
±*