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冯明菊,熊 华,王晓雅,孙 永
(南昌大学食品学院,食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047)
硒(Selenium,Se)是人体生命活动所必需的微量元素之一[1],目前认为生物体内发挥生理功能的硒形态主要是以硒代半胱氨酸为活性中心的硒蛋白。研究表明硒蛋白具有抗氧化[2]、增强机体免疫[3]、抗癌活性[4]、抗肿瘤活性[5]、拮抗有害重金属[6]、保护与修复营养细胞[7],抑制砷、铅、镉等重金属诱导的动物组织损伤、炎症反应等生物活性功能[8-10],由此可见硒蛋白对机体是重要的也是必需的。然而,硒的可利用资源十分有限且分布相当不均匀。据调查,我国有约72%的缺硒或低硒地区[11],并且由于硒的缺乏引发许多的疾病,如克山病、大骨节病、心脑血管疾病等[12-13]。
大米作为我国居民膳食主粮之一,是重要的膳食硒来源。人们从谷物食品中获得的硒约占饮食中总硒含量的70%,且与人体硒营养状况密切相关[14]。因此,通
过食物链途径强化硒元素,提高谷物中的硒含量,已成为目前功能性食品的研究热点之一。周鑫斌,Chen等[15-16]研究表明通过在土壤中或者叶面上施入适量的硒肥,利用水稻的生物富集和转化作用,可把无机硒转化为毒性低、安全有效的活性有机硒,提高大米中硒含量,改善糙米营养品质,被认为是一种低成本、安全、有效提高水稻硒含量的方法,已被广泛用于水稻中硒的富集。Fang等[17]研究发现,富硒大米中有机硒的主要存在形态是硒蛋白,且主要以硒代甲硫氨酸(selenomethionine,SeMet)形式存在,SeMet具有很高的生物活性。Liu等[18]通过碱提酸沉法提取糙米中的硒蛋白,探究其体外抗氧化活性,结果表明硒蛋白可显著清除机体内的超氧阴离子自由基、羟自由基和DPPH自由基,表现出较好的抗氧化活性。
本文主要以通过叶面喷施硒肥进行富硒处理后的三种富硒糙米为研究对象,探究三种富硒糙米中蛋白质、淀粉、粗脂肪、直链淀粉、脂肪酸含量的差异;通过碱提酸沉法提取富硒糙米蛋白并对其进行理化表征,包括蛋白质的分子量分布、氨基酸组成、红外光谱分析;同时测定硒蛋白的抗氧化活性(DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、还原力),并与对照品VC进行比较,以期系统、全面地了解富硒糙米蛋白氨基酸组成、结构特征及生物活性,为进一步评价富硒糙米的营养价值、筛选优质的富硒糙米等提供理论依据,对富硒大米的生产、开发及应用具有指导意义。
1 材料与方法
材料与仪器
双江口富硒糙米(Shuangjiangkou selenium-rich brown rice,SSR)、桃源富硒糙米(Taoyuan selenium-rich brown rice,TSR)、麻阳富硒糙米(Mayang selenium-rich brown rice,MSR)、普通糙米(Ordinary brown rice,OR) 湖南省桃源县富硒产业基地提供;1,1-二苯基苦酰基苯肼(DPPH) 生化试剂,美国Sigma;铁氰化钾 分析纯,西陇化工;水杨酸 分析纯,国药集团。
AFS8230型原子荧光分光光度计 北京吉天有限公司;TU-1900型可见紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;S-433D型氨基酸分析仪 德国Skynm公司;Nicolet5700型傅里叶红外光谱仪 美国Thermo Nicolet 仪器公司;7890B型高效气相色谱仪 美国安捷伦公司;K9840型自动凯氏定氮仪 济南海能仪器股份有限公司;SPX-250型电泳仪 美国Bio-Rad 公司;DFY-500型粉碎机 浙江大德仪器厂。
实验方法
糙米富硒处理 富硒糙米原料均通过叶面喷施硒肥的方式进行富硒处理,喷施的硒液浓度为40 mg/kg,孕穗期一次,灌浆期一次,均匀喷到叶面呈现雾滴状。
富硒糙米样品前处理 富硒糙米于烘箱中60 ℃烘干,用实验室规模的粉碎机磨粉后过100目筛,-20 ℃保存备用。
富硒糙米中营养成分的测定
蛋白质 蛋白质含量的测定方法参照GB -2016 食品安全国家标准“食品中蛋白质的测定”中的凯氏定氮法[19],。
淀粉 淀粉含量的测定方法参照GB -2016食品安全国家标准 “食品中淀粉的测定”中的酸水解法[20],先测定出还原糖的含量,最后折算成淀粉含量。
粗脂肪 粗脂肪含量测定方法参照GB -2016 食品安全国家标准“食品中脂肪的测定”中的索氏提取法[21]进行测定。
直链淀粉 参考郭天宇等[22]的方法,并稍作修改。称取过100目筛,且85%甲醇脱脂后的糙米样粉(100±) mg,置于离心管中,加入 mL 95% mL moL/L NaOH溶液,轻摇均匀,置于沸水浴中加热10 min,取出冷却至室温后转移至100 mL容量瓶中,加水定容并剧烈振摇混匀。 mL样品溶液,加入已盛有一半蒸馏水的100 mL容量瓶中, mL mol/L的乙酸溶液, mL碘试剂,加水至刻度,摇匀,静置10 min。 mL mol/L NaOH溶液代替样品做空白。在波长720 nm处测样品液的吸光值。用马铃薯直链淀粉和支链淀粉制备标准曲线,计算直链淀粉含量。
总硒含量的测定 糙米样品中硒含量的测定采用氢化物原子荧光光谱法(HG-AFS),参考Liu等[23]的方法,并做部分修改。将磨粉过筛的样品用正己烷脱脂, g( g)样品于消化管中, mL硝酸,轻微振摇混合均匀,于微波消解仪中消化,消解结束待冷却后,将消化管转移至高温加热箱中继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现,停止加热,切不可蒸干。待冷却后全部转移至25 mL容量瓶中,用超纯水定容,混匀待测,同时做空白对照。
有机硒含量测定 参考方建军等[24]方法,稍作修改。 g,加少量超纯水后,在研砵中碾磨使细胞充分破裂,定量转移至事先准备好的透
析袋中,用超纯水在烧杯中透析24 h,每 h离心更换一次超纯水,将透析后的样品取出,在离心机中12000 r/min离心15 min,取沉淀,冷冻干燥。 g( g)样品于消化管中, mL硝酸,轻微振摇混合均匀,于微波消解仪中消化,消解结束待冷却后,将消化管转移至高温加热箱中继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现,停止加热,切不可蒸干。待冷却后全部转移至25 mL容量瓶中,用超纯水定容,混匀待测,同时做空白对照。
脂肪酸组成成分测定
糙米油脂的提取 参考喻凤香等[25]方法,稍作修改。称取糙米粉100 g,用500 mL正己烷分3次浸提,～ h,旋转蒸发去除溶剂,收集油脂样品。
样品油脂甲酯化 参考喻凤香等[25-26]的方法,稍作修改。准确称取 mg油脂样品于10 mL玻璃试管中, mL正己烷,40 μL的乙酸甲酯和100 μL mol/L的甲醇钠溶液,漩涡混匀,于37 ℃下水浴加热30 min,使其甲酯化,并适当振摇。取出后置冰箱冷却10 min,迅速加入60 μL饱和的草酸溶液,离心(4000 r/min, min)去除沉淀。取上清液过无水硫酸钠,氮吹至干。 mL正己烷(色谱纯),摇匀, μm膜过滤,上样进行GC分析。
GC的测定条件 色谱柱为CP-Sil 88(100 m×250 μm× μm);检测器为火焰离子化检测器(FID);载气为H2(纯度≥%);进样口温度为250 ℃;检测器温度为250 ℃;升温程序:起始温度45 ℃ min, ℃/min速率升到175 ℃,保持27 min, ℃/min速率升到215 ℃,保持30 min; μL。
蛋白质的提取及蛋白硒含量测定 参考Liu[27],Fang[28]等方法,稍作修改。富硒糙米粉碎后过100目筛,正己烷(W/V=1∶3) h,通风橱过夜使溶剂挥发。称取脱脂富硒糙米粉适量, mol/L NaOH(料液比=1∶20)～ h后,在4700 r/min下离心15 min,得到上清液,重复上述操作一次,合并上清液,,然后在4700 r/min下离心15 min,得到蛋白质沉淀物,透析,冷冻干燥。提取的富硒糙米蛋白分别命名为双江口富硒糙米蛋白(SSRP),桃源富硒糙米蛋白(TSRP),麻阳富硒糙米蛋白(MSRP),普通糙米蛋白(ORP)。通过凯氏定氮测定蛋白纯度,。
SDS-PAGE法测定分子量及亚基组成
制胶 按照SDS-PAGE试剂盒上各种胶配比分别配制12%分离胶,%浓缩胶,其中TEMED和10%过硫酸铵最后加入,在加入前需混匀前面所加试剂。
电极缓冲液配制 g Tris, g甘氨酸, g SDS,加蒸馏水充分搅拌溶解,定容至1000 mL,室温保存。
5×样品缓冲液 组成为25%(v/v) mol/L Tris-HCI(),50%(v/v)甘油,0. 5%(w/v)溴酚蓝,10%(w/v)%(v/v)β-琉基乙醇,小份( mL/份)分装,-20 ℃保存。
样品溶解 称取富硒糙米蛋白样品溶于样品缓冲液中, mg/mL的样品溶液,样品溶解后于100 ℃ min使其变性,取出,冷却至室温后于6000 r/min离心10 min,上清液即为电泳样品。上样前取上清液进行5倍稀释后即可上样,上样量为10 μL。
电泳 在室温条件下,开始时浓缩胶中的电流为恒流 15 mA,当样品完全进入分离胶后加大电流至 25 mA, cm时,停止电泳。
染色与脱色 h,取出用水小心冲洗去表面染色液,置于脱色液中于摇床上进行反复脱色,直至凝胶上背景色脱净为止结束。其中,脱色液为50 mL乙醇,75 mL冰醋酸定溶至1000 mL; g考马斯亮蓝R-250,50 mL乙醇, mL冰醋酸,加水定容至100 mL,过滤除去杂质。
傅里叶红外光谱分析 参照雷红灵[29]的方法,称取干燥后的富硒糙米蛋白样品和溴化钾按1∶100混合,研磨均匀,压制成薄片,用红外光谱仪进行扫描,绘制红外光谱图并进行对比分析。扫描的波数范围为400～4000 cm-1,扫描次数为32次, cm-1,测定结果应扣除溴化钾背景光谱。
氨基酸的组成分析 g, moL/L HCL,110 ℃下加热水解22 h,用氨基酸自动分析仪测定氨基酸组成及各种氨基酸的质量分数。
富硒糙米蛋白的抗氧化活性
·OH的清除能力的测定 本实验采用水杨酸法测定样品清除羟基自由基的活性。参考胡玲玲等[2]的方法,稍作修改。分别配制不同浓度的样品溶液。 mL mmol/ mL mmol/L的水杨酸-乙醇溶液,混匀, mL不同浓度的样品溶液, mL mmol/L的过氧化氢溶液启动反应,用蒸馏水定容至10 mL,漩涡混匀后在37 ℃水浴锅中反应15 min,以超纯水为参比物质,在510 nm 处测定
吸光度,每组试验做三组平行对照,空白组中不加样品,对照组中用蒸馏水代替过氧化氢溶液,计算清除率。
式中:A0-空白组的吸光值;A2-加入样品的吸光值;A1-对照组的吸光值。
在实验中,选用了相同浓度的天然抗氧化剂抗坏血酸(VC)与硒蛋白的抗氧化活性进行对照,每种样品重复三次平行实验,取平均值。
1,1-二苯基苦酰基苯肼(DPPH)自由基清除能力的测定 参考Zhang等[30]的方法,稍作修改。×10-4mol/L的DPPH溶液, ℃避光保存备用,现配现用。 mL不同浓度的硒蛋白样品溶液于试管中, mL配制好的DPPH溶液,漩涡混匀后,在室温条件下避光反应30 min,用无水乙醇作参比液,于517 nm处测定其吸光度值A2。 mL DPPH溶液的吸光度值A0, mL的乙醇溶液,每组试验做三组平行对照,计算清除率。以抗坏血酸作对比,分析对比不同含硒量糙米蛋白对DPPH·的清除能力。按下式计算DPPH·清除率:
表1 富硒糙米中硒含量及各营养成分含量Table 1 The content of selenium and nutritive components of selenium-enriched brown rice
式中:A2为DPPH溶液和样品溶液的混合溶液的吸光度值;A1为样品溶液的吸光度值;A0为DPPH溶液的吸光度值。
还原力的测定 本实验采用铁氰化钾法测定样品还原力。参考刘昆仑[5]等方法,稍作修改。 mL不同浓度的样品溶液于试管中, mL mol/L的PBS缓冲溶液() mL %的铁氰化钾溶液,漩涡混匀,50 ℃水浴20 min。取出后冰浴迅速冷却至室温, mL 10%的三氯乙酸溶液(TCA),振荡混匀,在3000 r/min下离心10 min。 mL, mL %的三氯化铁溶液,混匀,于室温下暗处静置反应10 min,于700 nm处测定其吸光度值,每组试验做三组平行对照,以无水乙醇作参比溶液。以抗坏血酸作对照,评价不同含硒量糙米蛋白对三价铁离子的还原力。
数据处理
2 结果与分析
富硒糙米硒含量及各营养成分含量
许多研究表明[31-32],水稻对硒具有生物富集作用,在富硒农产品栽培过程中,通过叶面喷施硒肥会影响植物对硒的吸收利用,从而也会不同程度的影响到其它
营养成分的积累。本实验通过氢化物原子荧光光谱法测得双江口富硒糙米(SSR)、桃源富硒糙米(TSR)、麻阳富硒糙米(MSR)、普通糙米(OR)±、±、±、± μg/kg。富硒糙米中的硒含量均显著高于普通糙米蛋白且三种富硒糙米中的硒含量存在显著性差异(P<),此结果与Zhang[33]、Deng[34]等研究一致,即通过叶面喷施硒肥进行富硒处理可显著提高糙米中的硒含量,且不同品种糙米中硒富集量差异显著。这主要可能是由于不同品种的稻米对硒吸收和利用的效果不同,从而导致水稻籽粒中的硒含量不同[35]。
直链淀粉含量是评价糙米品质的一个重要指标之一,与蒸煮品质及食味品质的好坏有着密切的关系[36]。本实验利用马铃薯直链淀粉和支链淀粉绘制标准曲线(y=+,R2=),测得SSR、TSR、MSR、%、%、%、%,富硒富硒糙米中直链淀粉的含量略高于普通糙米。
同时,由表1中可知,SSR、TSR、MSR、OR中脂肪、淀粉等营养成分的含量无显著性的差异(P>),但蛋白质含量差异显著(P<),%,产生这一现象的主要原因可能是[37]:对水稻进行富硒处理时,由于品种之间的差异导致水稻对硒的富集及转化能力不同,而硒在转化过程中会与硫产生竞争作用,硒沿着硫的吸收和代谢途径取代了硫元素并与蛋白质中的半胱氨酸和蛋氨酸结合,形成了硒代氨基酸化合物,进一步被转运至水稻籽粒中以硒蛋白的形式贮存在蛋白质中,从而造成蛋白质含量存在显著性差异。此结果与Hu等[38],吴得峰[39],朱文东[40]的研究结果一致,即通过叶面喷施适量硒肥可提高大米中蛋白质含量,但对脂肪、灰分等含量影响不显著。