CD59特异位点短肽封条对T细胞封闭作用.doc

CD59特异位点短肽封条对T细胞封闭作用.docCD59特异位点短肽封条对T细胞封闭作用
【关键词】抗原,CD59;短肽封条;肿瘤;T淋巴细胞;细胞增殖
CD59是小分子的高度糖基化的GPI锚固蛋白,广泛分布于造血细胞、非造血细胞及多种组织细胞表面,其主要功能是调节补体活化,通过与补体攻膜复合物(MAC)装配过程中的C8和(或)C9结合从而抑制补体的活化[1]。除了已被广泛认知的调节补体作用外,还具有细胞信号传导的功能[2]。有研究显示,肿瘤病人机体处于免疫失平衡状态,且这种失平衡与T细胞信号传导缺陷相关[3]。在肿瘤病人机体中,T细胞表达的CD59在细胞信号传导过程中发挥何种作用及对T细胞活性产生何种影响,在国内外文献中尚未见报道。本文通过建立小鼠肿瘤模型,研究荷瘤机体中CD59对T细胞活性的影响,并将本室研制的利用噬菌体肽库筛选技术体外合成的针对CD59活性位点的短肽封条(sp)[4]应用于T细胞,观察其对T细胞的封闭作用并探讨其可能机制。
1材料与方法


HeLa细胞由本室保存,含有CD59特异位点的短肽封条系本室自制。RPMI1640培养液(Gibco公司),标准胎牛血清(FCS),淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限公司),MTT(中国医学科学院血液研究所),Hepes(Solarbio公司),ConA(Sigma公司)。


取BALB/C纯系小鼠32只,雌雄各半,3~4周龄,体质量18~22g。随机分为2组:Ⅰ;Ⅱ组每只小鼠腋窝皮下注射108/。每天观察记录,于第20天处死小鼠[5]。


无菌分离Ⅰ组、Ⅱ组小鼠胸腺,制备单细胞悬液,淋巴细胞分层液分离获取单个核细胞,再经尼龙毛柱处理获取T淋巴细胞,锥虫蓝染色细胞活率95%以上。调整细胞浓度为4×108/L,、青链霉素双抗的RPMI1640培养液10mL,放入37℃。
、C4的测定

自小鼠心脏取血,置37℃水浴30min,然后以2000r/min离心10min,在美国德灵公司BNP全自动特种蛋白分析仪上检测。
(MTT)微量酶反应比色法检测淋巴细胞的增殖情况
mAb、sp对小鼠T细胞增殖影响设定空白对照组、ConA对照组、ConA+CD59mAb(1、2、4mg/L)组、ConA+含有CD59特异位点的sp(、、)组,每组各设3个复孔。取前期准备的正常小鼠T淋巴细胞,调整细胞浓度为4×108/L,加入96孔板中,每孔为100μL,按上述分组加入相应试剂,每孔50μL。放入37℃,然后每孔加入MTT10μL,振荡混匀,放入37℃。而后加入100g/LSDS,每孔100μL,充分吹打混匀20min至完全溶解。全自动酶标检测仪测570nm波长处吸光度(A)值。mAb、sp对不同实验组小鼠T细胞增殖的影响调整Ⅰ组、Ⅱ组的T淋巴细胞浓度为4×108/L,加入96孔板中,每孔10