CD59特异位点短肽封条对T细胞封闭作用.doc

CD59特异位点短肽封条对T细胞封闭作用　.doc:..CD59特异位点短肽封条对T细胞封闭作用59特异位点的短肽封条能抑制T细胞增殖,两者的作用与正常对照相比差异有显著性(t=、,PT细胞信号转导而与补体抑制作用无关,含有CD59特异位点的短肽封条对T细胞起封闭作用。【关键词】抗原,CD59;短肽封条;肿瘤;T淋巴细胞;细胞增殖CD59是小分子的高度糖基化的GPI锚固蛋白,广泛分布于造血细胞、非造血细胞及多种组织细胞表面,其主要功能是调节补体活化,通过与补体攻膜复合物(MAC)装配过程中的C8和(或)C9结合从而抑制补体的活化[1]。除了己被广泛认知的调节补体作用外,还具有细胞信号传导的功能[2]。有研宄显示,肿瘤病人机体处于免疫失平衡状态,且这种失平衡与T细胞信号传导缺陷相关[3]。在肿瘤病人机体中,T细胞表达的CD59在细胞信号传导过程中发挥何种作用及对T细胞活性产生何种影响,在国内外文献中尚未见报道。本文通过建立小鼠肿瘤模型,研究荷瘤机体中CD59对T细胞活性的影响,并将本室研制的利用噬菌体肽库筛选技术体外合成的针对CD59活性位点的短肽封条(sp)[4]应用于T细胞,观察其对T细胞的封闭作用并探讨其可能机制。1材料与方法试剂HeLa细胞由本室保存,含有CD59特异位点的短肽封条系本室自制。RPMI1640培养液(Gibco公司),标准胎牛血清(FCS),淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限公司),MTT(中国医学科学院血液研究所),Hepes(Solarbio公司),ConA(Sigma公司)。动物选择与分组取BALB/C纯系小鼠32只,雌雄各半,3〜4周龄,体质量18〜22g。随机分为2组:I组每只小鼠腋窝皮下注射生理盐水;II组每只小鼠腋窝皮下注射108/L的HeLa细胞。每天观察记录,于第20天处死小鼠[5]。细胞制备无菌分离I组、II组小鼠胸腺,制备单细胞悬液,淋巴细胞分层液分离获取单个核细胞,再经尼龙毛柱处理获取T淋巴细胞,锥虫蓝染色细胞活率95%以上。调整细胞浓度为4X108/L,加入含体积分数的FCS、青链霉素双抗的RPMI1640培养液10mL,放入37°C含体积分数的C02温箱中培养。补体C3、C4的测定自小鼠心脏取血,置37°C水浴30min,然后以200Or/min离心10min,在美国德灵公司BN?P全自动特种蛋白分析仪上检测。四甲基偶氮唑盐(MTT)微量酶反应比色法检测淋巴细胞的增殖情况不同浓度CD59?mAb、sp对小鼠T细胞增殖影响设定空白对照组、ConA对照组、ConA+CD59?mAb(1、2、4mg/L)组、ConA+含有CD59特异位点的sp(、、/L)组,每组各设3个复孔。取前期准备的正常小鼠T淋巴细胞,调整细胞浓度为4X108/L,加入96孔板中,每孔为100uL,按上述分组加入相应试剂,每孔50uL。放入37°C含体积分数的C02温箱中孵育48h,然后每孔加入MTT10uL,振荡混匀,放入37°C含体积分数的C02温箱中孵育4h。而后加入1OOg/LSDS?/LHCl,每孔100PL,充分吹打混匀20min至完全溶解。全自动酶标检测仪测570nm波长处吸光度(A)值。?mAb、sp对不同实验组小鼠T细胞增殖的影响调整I组、II组的T淋巴细胞浓度为4