如何阅读质粒图谱.doc

如何阅读质粒图谱-也谈谈您的经验!?
载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
一、           一个合格质粒的组成要素
复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
Ø         抗生素抗性基因:可以便于加以检测,如Amp+ ,Kan+
Ø         多l克隆位点:MCS克隆携带外源基因片段
Ø          P/E 启动子/增强子
Ø          Terms 终止信号
Ø         加poly(A)信号:可以起到稳定mRNA作用
二、            如何阅读质粒图谱
第一步:首先看Ori的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)
第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记:
(1)Ampr 水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。
(2)tetr 可以阻止四环素进入细胞。
(3)camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。
(4)neor(kanr) 氨基糖苷磷酸转移酶使G418(长那霉素衍生物)失活。
(5)hygr 使潮霉素β失活。
第三步:看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点,便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步:再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。
第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。
相关概念:
启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号
启动子-促进DNA转录的DNA顺序,这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游,是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。
 增强子/沉默子-为真核l基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。沉默子-负增强子,负调控序列。
核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是AUG(起始密码)和SD序列。
SD序列(Shine-Dalgarno sequence):mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。
SD序列:在细菌mRNA 起始密码子AUG上游10个碱基左右处,有一段富含嘌呤的碱基序列,能与细菌16SrRNA3’端识别,帮助从起始AUG处开始翻译。在原核生物中, 核糖体中与mRNA结合位点位于16S rRNA 的3'端,mRNA中与核糖体16S rRNA结合的序列称为SD序列(SD sequence), 和 ,故此而命名。SD序列是mRNA中5'端富含嘌呤的短核苷酸序列,一般位于mRNA的起始密码AUG的上游5~10个碱基处,并且同16