☆如何阅读质粒图谱.doc

如何阅读质粒图谱最近由于实验需要, 需要查阅载体图谱, 到园子里搜罗一番, 发现虽然有人问载体图谱阅读的问题, 也有前辈回答, 但都不详细, 借自己也在琢磨这个问题的机会, 将我学到的东西整理一下,于大家分享。载体主要有病毒和非病毒两大类, 其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一、一个合格质粒的组成要素# 复制起始位点 Oril 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。# 抗生素抗性基因可以便于加以检测,如 Amp+l ,Kan+ #多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段 l # P/E 启动子/ 增强子 l# Termsl 终止信号#加 poly (A )信号 l 可以起到稳定 mRNA 作用二、如何阅读质粒图谱第一步: 首先看 Ori 的位置,了解质粒的类型( 原核/ 真核/ 穿梭质粒) 第二步: 再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。(1) Ampr 水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。(2) tetr 可以阻止四环素进入细胞。(3) camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。(4) neor ( kanr ) 氨基糖苷磷酸转移酶使 G418 (卡那霉素衍生物)失活(5) hygr 使潮霉素β失活。第三步: 看多克隆位点( MCS ) 。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入, 会导致某种标志基因的失活, 而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步: 再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源 DNA 片段。一般来说,外源 DNA 片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号#启动子-促进 DNA 转录的 DNA 顺序,这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码顺序的上游, 是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。#增强子/ 沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/ 沉默子-负增强子,负调控序列。#核糖体结合位点/ 起始密码/SD 序列( Rbs/AGU/SDs ): mRNA 有核糖体的两个结合位点, 对于原核而言是 AUG (起始密码)和 SD 序列。 l #转录终止顺序( 终止子)/ 翻译终止密码子: 结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列, 此位点 down - stream 有一段 GT 或T 富丰区,这2 部分共同构成 poly (A) 加尾信号。回答有人之前提出的一个问题: 为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针? 那其实是代表两条 DNA 链,即质粒是环状双链 DNA ,它的启动子等在其中一条链上,而它的抗性基因在另一条链上. 三、介绍一下关于载体的知识(虽然课本上都有写) 1. 什么是载体即要把一个有用的基因( 目的基因——研究或应用基因) 通过基因工程手段送到生物细胞( 受体细胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体( vector )。 . 基因工程所用的 vector 实际上是 DNA 分子,是用来携带目的基因片段进入受体细胞的 DNA 2. 载体的分类#按功能分成: ( 1) 克隆载体都有一个松弛的复制子, 能带动外源基因, 在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增 DNA 片段( 基因) 的载体。( 所以有时实验时扩增效率低下, 要注意是不是使用的严谨型载体) ( 2 )表达载体具有克隆载体的基本元件( ori,Ampr,Mcs 等)还具有转录/ 翻译所必需的 DN A 顺序的载体。#按进入受体细胞类型分:( 1 )原核载体( 2 )真核载体( 3 )穿梭载体( sbuttle vector ) 指在两种宿主生物体内复制的载体分子,因而可以运载目的基因(穿梭往返两种生物之间) . . 穿梭质粒含原核和真核生物 2 个复制子,以确保两类细胞中都能扩增。 3. 基因工程载体的 3 个特点: (一) 都能独立自主的复制: 载体 DNA 分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域,如 MCS , 插在其中的外源 DNA 片段,能被动的跟着载体一起复制/ 扩增,就像载体的正常成分一样。(二) 都能便利的加以检测: 如载体的药物抗性基因, 多