如何阅读质粒图谱.doc

如何阅读质粒图谱更新2011-5-25如何阅读质粒图谱最近由于实验需要,需要查阅载体图谱,到园子里搜罗一番,发现虽然有人问载体图谱阅读的问题,也有前辈回答,但都不详细,借自己也在琢磨这个问题的机会,将我学到的东西整理一下,于大家分享。载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。一、一个合格质粒的组成要素#复制起始位点Oril即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。#抗生素抗性基因可以便于加以检测,如Amp+l,Kan+#多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段l#P/E启动子/增强子l#Termsl终止信号#加poly(A)信号l可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步:首先看Ori的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。(1)Ampr水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。(2)tetr可以阻止四环素进入细胞。(3)camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。(4)neor(kanr)氨基糖苷磷酸转移酶使G418(卡那霉素衍生物)失活(5)hygr使潮霉素β失活。第三步:看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步:再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号#启动子-促进DNA转录的DNA顺序,这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游,是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。#增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子-负增强子,负调控序列。#核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是AUG(起始密码)和SD序列。l#转录终止顺序(终止子)/翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。1-6回答有人之前提出的一个问题:为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针?那其实是代表两条DNA链,即质粒是环状双链DNA,它的启动子等在其中一条链上,、介绍一下关于载体的知识(虽然课本上都有写)(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector)。