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第十四章基因克隆技术
1962年Okada和Tadokoro发现灭活的仙台病毒有促进细胞融合
的作用。这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘
故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。
此外,用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)作为细胞融合剂,
它可引起邻近的细胞膜的粘合,继而使细胞融合成为一个细胞。
第一节动物细胞融合技术
定义:指用自然或人工方法、使两个或更多个不同的细胞融合成一个细胞的过程,又称为体细胞杂交
细胞融合是正常的生命活动
两个细胞正在融合
受精作用
诱导方式
物理法
化学法
生物法:
灭活的病毒
仙台病毒
紫外线
丧失感染性
(不感染细胞)
保留融合活性
(诱导细胞融合)
诱导方法
细胞A
细胞B
杂种细胞
灭活的病毒
物理法
化学法
仙台病毒
疱疹病毒
新城鸡瘟病毒
植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较
比较项目
植物体细胞杂交
动物细胞融合
细胞融合原理
细胞膜的流动性、
细胞膜的流动性
细胞融合的方法
去除细胞壁后诱导原生质体融合
使细胞分散后诱导细胞融合
诱导方法
物理(离心、振荡、电刺激)
化学(聚乙二醇)
物理、化学方法(同左)
灭活的病毒
用途
获得杂种植株
制备单克隆抗体
(PEG)介导的细胞融合
原理:PEG带有大量的负电荷,和原生质体表面的负电荷在钙离子的连接下,形成静电键,促使异源的原生质体间的粘着和结合,在高pH,高钙离子的溶液的作用下,将钙离子和与质膜结合的PEG分子洗脱,导致电荷平衡失调并重新分配,使两种原生质体上的正负电荷连接起来,进而形成具有共同质膜的融合体。
影响因素:
分子量:400—6000(通常:1000—4000)
浓度: 20—60% (通常:30—50%)
时间: 悬浮法 1—2 min
离心法 5—8 min
pH: 偏碱为宜(—)
其他: 二甲亚砜、植物血凝素
细胞电融合
原理:
悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的细胞,在1—100MHz和100—1000V/cm的交流电场中,会向小电极移动,并极化成偶极子,而沿电场方向发生双向电泳,此时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲,即可使相邻细胞膜的接触区产生可逆电降解,从而触发细胞融合。
甜菜原生质体电融合过程
1)在高频电流电场下的相互接触。
2)脉冲刺激后30s
3)50秒后
4)
5)6分钟后
6)15分钟后,原生质体融合完成。