[优秀论文]高迁移率族蛋白1与内皮细胞通透性的实验研究.pdf

上海交通大学博士学位论文高迁移率族蛋白1与内皮细胞通透性的实验研究姓名:郑运江申请学位级别:博士专业:外科学指导教师:汤耀卿20090501上海交通大学医学院博士学位论文中文捕要高迁移率族蛋白1与内皮细胞通透性的实验研究摘要目的研究高迁移率族蛋白1对内皮细胞(ECs)通透性的影响并初步探讨其作用机制。方法(1)体外培养人内皮细胞系(),,,流式细胞术测定细胞膜表面晚期糖基化终产物受体(RAGE)的表达。(2)不同剂量的高迁移率族蛋白1(删GBl)以及100ng/ml的HIVIGBl于不同时间点刺激ECs(ECs),采用Transwellchamber弥散模型,以荧光光谱仪测定异硫氰酸荧光素(FITC)标记的葡聚糖(Dextran)透过Transwell小室的荧光强度,表示人血管ECs单细胞层的通透性大小;(3)I-IIvIGBl刺激ECs,激光共聚焦显微镜观察ECs骨架肌动蛋白(F-actin)、紧密连接蛋白(ZO—1)和黏附连接蛋白(VE-cadherin)的形态分布以及蛋白免疫印迹法检测ZO一1和VE-cadherin蛋白的表达。(4)Pull-down法检测HMGBI诱导的Rho—GTP的活性表达;细胞免疫组化法、免疫印迹和免疫荧光法分别检测HMGBI诱导的RhoA蛋白、肌球蛋白轻链磷酸化(P—MLC)表达以及Rho上海交通文学医学院博士学位论文中文捕要激酶(ROCK)特异性抑制剂Y27632、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)特异性抑制剂ML-9干预后P-MLC表达的变化;激光共聚焦显微镜观察在抑制剂C3-转移酶、Y27632、ML一9干预后F-actin、ZO一1和VE-cadherin的形态分布变化、荧光光谱仪测定ECs通透性的变化以及免疫印迹法测定ZO-1和VE-cadherin蛋白表达水平的变化;结果(1),铺路石状镶嵌排列,胞浆表达VIII因子呈强阳性,具有典型的ECs特征;。(2)与对照组相比,HMGBI显著诱导ECs通透性增高(P<),且ECs通透性随HMGBl剂量增大或作用时间延长而增高:HMGBllOOng/ml作用12h(P<),作用24h(P<);150ng/ml作用12h(P<),作用24h(P<)。(3)相比较于对照组,HMGBl诱导F-actin发生重组,产生张力纤维丝,细胞间裂隙(gaps)形成增多;ZO-1分布不规则,荧光强度减弱,部分密闭环开放;VE—cadherin排列紊乱、失去连续性、片段化分布于细胞边界;上述损伤性变化随着HMGBl作用时间或剂量增大而加重。而且,HMGBI诱导Z0—1和VE—cadherin蛋白表达明显减少而且具有时间效应。(4)HMGBl快速诱导Rho蛋白的激活,MLC的磷酸化水平显著增高,C3-转移酶和Y27632能够明显降低MLC的磷酸化水II上海交通文学医学院博士学位论文中文摘要平,抑制ECsF-actin的解聚和重排,部分恢复ZO-I和VE—cadherin的正常形态分布及其蛋白表达水平,抑制ECs通透性增高。而MLCK特异性抑制剂ML一9则不能抑制MLC的磷酸化水平,也对HMGBl诱导的ECsF-actin重组和内皮通透性增高无明显抑制作用。结论HMGBI通过诱导F-actin重组、ZO-1和VE-cadherin结构改变及表达变化,导致ECs收缩、细胞间裂隙形成,引发ECs通透性增高,其机制之一是通过Rho/ROCK信号通路发生作用,通过抑制其活性可减轻内皮屏障损伤及改善其通透性。关键词内皮细胞,高迁移率族蛋白l,Rho/ROCK,heeffectofhighmobilitygroupbox1(HMGB1)(1)Morphologicalcharacteristicsofhumanvascularendothelialcelllines()(RAGE).(2)Monolayerpermeabili