选育西罗莫司高产菌株的技术分析.doc

选育西罗莫司高产菌株的技术分析
【摘要】用紫外线对吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)NP03进行诱变,再采用庆大霉素抗性筛选法进行处理,剂量分别为0、、、,共获得113株抗性突变株,其中西罗莫司产量高于出发菌株的有51株,突变株NP0374#的生产能力达到出发菌株的134%,且遗传特性稳定。
【关键词】西罗莫司; 庆大霉素
【中图分类号】R472 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851(2014)2-0478-02
免疫抑制剂在器官移植排斥反应的预防和治疗中有极其重要的作用。自20世纪70年代环孢素A用于临床以来,器官移植的成功率大大提高,但探求新的、安全有效的免疫抑制剂的工作一直在继续。
西罗莫司(sirolimus)是由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)产生的大环内酯类抗生素,1977年Morris等首先发现其具有免疫抑制作用,1989年开始把西罗莫司作为治
疗器官移植的排斥反应的新药进行使用,临床应用显示它具有很好的抗排斥作用,与环孢菌素A和他克莫司(FK506)等免疫抑制有良好的协同作用,是一种疗效好、低毒、无肾毒性的新型免疫抑制剂。西罗莫司除用于器官移植抗排斥药物外,还可用于抗真菌、心血管支架涂料、I779的原料药,预防和治疗系统性红斑狼疮、胰岛素依赖型糖尿病等,应用前途广泛。
本文报道用庆大霉素对西罗莫司产生菌进行处理,以获得高产的抗性菌株。
1 材料与方法
出发菌株:吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)NP03(本实验室保存)。
培养基:分离培养基(%) ,,,。
斜面培养基天门冬素琼脂培养基。
种子培养基(%) ,,,;pH 自然。
发酵培养基(%) ,,,,;pH自然。
主要仪器:旋转式摇瓶机,高速离心机,Waters高效液相色谱仪。 菌种的选育方法
(1)制备单孢子悬液:取NP03菌株的新鲜斜面,加无菌水制成孢子悬液,脱脂棉过滤,收集单孢子悬液,调整其浓度为106个/ml。
(2)诱变处理:紫外线诱变将其孢子悬液置于15W紫外灯40cm处分别照射0、10、20和30s,然后稀释分离,培养。计数并统计致死率,确定紫外处理时间。
庆大霉素抗性突变株的筛选将用紫外诱变过的孢子悬液稀释成不同浓度,分别涂布在含有0、、、,28
℃培养10~16d,
计数,统计致死率;挑取不同浓度下及对照组的菌落,培养后进行摇瓶初筛和复筛。
效价测定:高压液相外标法。
2 结果与分析
最佳照射剂量的选择:考察紫外线照射时间对菌株致死率的影响。
紫外线有较强的杀菌能力和诱变能力,,NP03菌株对紫外的耐受力较弱,30s的致死率几乎达到100%,%,为保证有较高的筛选几率,选择20s的UV照射剂量。
UV照射