酵母菌的筛选方案.doc

第一部分:酵母筛选收集
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采用五点取样法从葡萄地土壤中取样。由于土壤中的微生物一般在5-25cm的土层里,所以先用灭菌铲除去土壤的表皮,然后采取土壤200-300g,至于无菌塑料袋内,并标明采取地点、日期。将其运回实验室后至于冰箱中保存,备用。
将采回的样品用四分法获取样品20-30g,将其置于研钵中研磨均匀。
2. 土壤中菌种的分离:
称取1 g土壤,置于液体培养基灭菌葡萄汁,经28 ℃,12 h,180 rpm摇床富集培养。取1 ml富集培养液,分别进行五个梯度稀释(1:1000、1:5000、1:10000、1:50000、1:100000),,注入平板上,利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面(注意不能使培养基表面破裂),将培养皿盖好,再把培养皿倒置,于适宜温度(一般为25℃或28℃)的恒温箱中培养,每个梯度做三个重复。观察培养基,直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。
为了在筛选过程中排除细菌的干扰,在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。
观察并记录菌落颜色与形态,然后在显微观察记录细胞大小、形态,进行分析和初步的归类。
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1. 葡萄的采集:
葡萄成熟时,在葡萄果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在,因此在采收葡萄时,将果梗与葡萄一起采收。由于酵母菌在稍微破裂的葡萄果实中大量存在,采收时可以选取有裂纹的葡萄,但是,将完整无损的葡萄与有裂纹的分开装袋。运回实验室置于冰箱中保存,备用。
2. 菌种分离步骤:
将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。
随机选取并称量约 10g成熟葡萄,放入盛有 90ml 无菌水的三角瓶,
分别按30ug/ml添加链霉素,然后振荡培养 30min后静置,制成菌悬液,吸取 50µl 放入 YEPD固体培养基,三个重复,以无菌刮铲刮匀,25℃培养 24~48h。观察菌落的大小及生长状况。
然后将静置后的菌悬液进行梯度稀释(10-3、10-4、10-5、10-6、10-7),,注入平板上,利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面(注意不能使培养基表面破裂),将培养皿盖好,再把培养皿倒置,于适宜温度(一般为25℃或28℃)的恒温箱中培养,每个稀释度做三个重复。
为了在筛选过程中排除细菌的干扰,在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。
观察并记录菌落颜色与形态,然后在显微观察记录细胞大小、形态,进行分析和初步的归类。
三. 自然发酵过程中酵母菌的分离:
将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。
称量约 100g 新鲜成熟度好的各品种葡萄,手工破碎,放入无菌的 500ml 三角瓶,接着分别按30ug/ml添加链霉素,置于28℃培养,每隔 24h 取发酵液1ml,加入 9 ml无菌水中,然后进行梯度稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7,取样时期分别为:I,葡萄浆果破碎压榨后(添加SO2);II,发酵旺盛期,葡萄汁含糖量下降20%时;III,发酵后期,葡萄汁含糖量下降70%时;IV,发酵结束前,残糖10%以下时。
取 稀释后各菌液放入固体培养基,涂布均匀(注意不能