酵母菌的分离筛选方法.doc

酵母菌的分离筛选方法酵母菌多数为腐生,一般生长在含糖较高,偏酸的环境中,在通气条件下,液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似,较大而厚,多数不透明,菌落光滑湿润粘稠,乳白色,少数干皱,边缘整齐,呈红色或粉红色,圆形椭圆卵形,液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。含高糖浓度(45%),分离蜂蜜酵母,球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1、培养基:1、1葡萄糖50g/L尿素1g/L(NH4)2SO41g/LKH2PO42、5g/LNa2HPO40、5g/LMgSO41g/LFeSO40、1g/L酵母膏0、5g/L孟加拉红0、03g/LPH4、5-5、0(富集用)★1、2乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基:马铃薯200g/L葡萄糖(霉菌用蔗糖)20g/L乳酸5ml马铃薯去皮切片200g,加水煮沸30min,纱布过滤,补足蒸馏水1L,PH自然。(去掉乳酸可用于酵母菌与霉菌培养用)(富集用)★1、3麦芽汁培养基:1:4水60-65℃水浴3-4小时,4-6层纱布过滤,可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫,倒入糖化液中,煮沸过滤,10-15波林,氯霉素0、1g/LPH6、0-6、4121℃20min(分离保存用)灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素(集菌用)1、4虎红(孟加拉红)培养基:蛋白胨5、0g/L葡萄糖10g/LKH2PO41、0g/LMgSO40、5g/L孟加拉红0、033g/L氯霉素0、1g/L琼脂15g/LPH自然(分离纯化用)★1、5豆芽汁培养基:黄豆芽100g/L葡萄糖50g/LPH自然。100g黄豆芽,加水煮沸30min,纱布过滤,补足蒸馏水1L1、6察氏培养基:主要培养霉菌观察形态用蔗糖30g/L硝酸钠3g/L磷酸氢二钾1g/L氯化钾0、5g/L硫酸镁0、5g/L硫酸亚铁0、01g/L琼脂15-20g/L121℃20minPH自然一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基,啤酒酵母用酒花麦汁培养基,葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。2、集菌:研究酵母菌生态与某种基物或样品中的酵母菌区系,一般不进行集菌,以免改变其中不同种类数量间的对比,将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株,加酸性含糖的培养基,酸性豆汁,必要时注入高浓度的酒精(13-17%),霉菌在液体中形成菌丝体,酵母不形成菌丝,25-28℃2-3d,遇到菌丝体用接种环挑去烧掉,去掉上清液,取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中,集菌连续两至三次才能完成,要配合镜检。实例:将待分离的样品10g(ml)放入90ml无菌水或生理盐水/150ml三角瓶(玻璃珠),摇床振荡20-30min,取上清液接种于酸性培养液(乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁)25-28℃2-3d,培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉,集菌连续两至三次,培养液变成混浊,产生菌膜与沉淀物。镜检:美兰染液染色,活菌可还原美兰染液,菌体无色。3、筛选:分离:取集菌液适当稀释,吸取0、1-0、2ml梯度菌液(至少两个两个平衡),涂布于马铃薯-葡萄糖麦芽汁或虎红培养基平板,也可采用混菌法或蘸取集菌菌液直接划线,(平放12h后倒置培养),25℃培养48h,低温酵母菌15℃高温酵母菌35℃40℃45℃,形成清晰菌落。在培养皿底划分小方格,待菌落生长良好后,用放大镜或低倍镜,观察每格内每个菌落编号并描述,颜色表面边缘切面等,再制片