扫描电镜制样.docx

扫描电子显微镜 (SEM)常规样品制备技术
SEM 常规制样方法(一)
——试样的取材、固定、脱水和置换
一、实验目的
掌握扫描电镜制样过程:从取材、固定、脱水、置换、干燥、喷涂这一过程中样品怎样
保持生活状态,从而得出接近生活状态的样品。
二、实验原理
不论动物或植物组织, 要求取材时操作必须快速, 组织表面要清洁, 必要时需超声波清
洗,原理同 TEM 取材,但需强调的是 SEM 观察表面结构,所以应注意表面结构的清洁、完
整和电镜下反应真实的形貌。取材时动作要快、轻、准、大小在 1mm-1cm 之间,所用的器
械要锋利、洁静,避免任何牵拉和挤揉样品表面的损伤,常用的固定剂有 2-4%戊二醛和 1%
锇酸。
三、实验器材
样品(动物或植物) 、双面刀片、培养皿、  离心管、牙签、 2-4%戊二醛、 1%锇酸、
0. 1M PBS 缓冲液,乙醇、乙酸异戊酯。
四、实验步骤
1、取材
要求动作轻、迅速、准确,为了保持生活状态,应在固定前清洗掉表面杂质,即,迅速
将标本放在 PBS缓冲液中冲洗,也可超声波器中超 10s-30s,使样品所带的污物除去(如:
气管内壁上的粘液、植物叶上的灰尘等) 。
2、固定(前固定)
经过清洗的样品迅速投入 2-4%戊二醛囤定液中, 间歇振荡且室温固定约 2-4 小时即可。
样品固定的目的: 使样品细胞的微细结构完整真实地保存下来。 如果样品没有很好地固
定,那么样品在脱水时可能变形,破坏了样品的生活状态,也就是说,固定不好的材料,电
镜下不能反映真实结构,所以这一步很重要。
3、冲洗
0. 1M  PBS缓冲液洗: 30 分钟中间换 3-4 次,因戊二醛与锇酸反应生成细微的沉
淀,所以在后固定之前,用 0. IM PBS缓冲液洗去多余的戊二醛之后,样品才可能进入锇
酸固定液。
4、后固定: 1%四氧化锇后固定 1-2 小时。
5、冲洗:重蒸水冲洗 30 分钟中间换 3-4 次,因四氧化锇与乙醇反应,所以在脱水前充
分洗去残留的四氧化锇,样品才能进行脱水。
6、脱水
脱水剂为乙醇,室温进行为了减少人工损伤,需要梯度脱水: 30%、50%、 70%、 80%、
90%、95%、100%,每级 15-20 分钟,如果是动物样品,脱水时间可 5-10 分钟,脱水要充分
完全地进行直到除尽样品中的水份为止, 最后 100%乙醇要重复 2-3 次,保证样品绝对无水。
7、置换:醋酸异戊酯 30 分钟或者过夜
样品脱水后,放入醋酸异戊酯中。样品在脱水时,样品中的水份被乙醇脱水剂替代,而
乙醇挥发较快易自然干燥, 固选用挥发较慢的乙酸异戊酯, 既能与 CO2 溶合, 又能与乙醇溶
合,作中间媒介液置换。
五、实验结果
要求学生写出实验报告。
SEM 常规制样方法(二)
——样品的临界点干燥
一、实验目的
1、掌握样品临界点干燥的目的。
2、掌握临界点干燥的操作和原理。
二、实验原理
我们知道物质有三态:固态、液态和气态。 在体积不变的情况下,它们在温度和压力变
更下可以相互转化。临界状态,就是在体积恒定状态下,调节 CO2 的温度即 32 ℃至 40℃之
间的某一个温度下,液体压强在 75 个 bar 以上,液体的