扫描电镜制样.docx

扫描电子显微镜(SEM)常规样品制备技术SEM常规制样方法(一)——试样的取材、固定、脱水和置换一、实验目的掌握扫描电镜制样过程:从取材、固定、脱水、置换、干燥、喷涂这一过程中样品怎样保持生活状态,从而得出接近生活状态的样品。二、实验原理不论动物或植物组织,要求取材时操作必须快速,组织表面要清洁,必要时需超声波清洗,原理同TEM取材,但需强调的是SEM观察表面结构,所以应注意表面结构的清洁、完整和电镜下反应真实的形貌。取材时动作要快、轻、准、大小在1mm-1cm之间,所用的器械要锋利、洁静,避免任何牵拉和挤揉样品表面的损伤,常用的固定剂有2-4%戊二醛和1%锇酸。三、实验器材样品(动物或植物)、双面刀片、培养皿、、牙签、2-4%戊二醛、1%锇酸、,乙醇、乙酸异戊酯。四、实验步骤1、取材要求动作轻、迅速、准确,为了保持生活状态,应在固定前清洗掉表面杂质,即,迅速将标本放在PBS缓冲液中冲洗,也可超声波器中超10s-30s,使样品所带的污物除去(如:气管内壁上的粘液、植物叶上的灰尘等)。2、固定(前固定)经过清洗的样品迅速投入2-4%戊二醛囤定液中,间歇振荡且室温固定约2-4小时即可。样品固定的目的:使样品细胞的微细结构完整真实地保存下来。如果样品没有很好地固定,那么样品在脱水时可能变形,破坏了样品的生活状态,也就是说,固定不好的材料,电镜下不能反映真实结构,所以这一步很重要。3、:30分钟中间换3-4次,因戊二醛与锇酸反应生成细微的沉淀,所以在后固定之前,,样品才可能进入锇酸固定液。4、后固定:1%四氧化锇后固定1-2小时。5、冲洗:重蒸水冲洗30分钟中间换3-4次,因四氧化锇与乙醇反应,所以在脱水前充分洗去残留的四氧化锇,样品才能进行脱水。6、脱水脱水剂为乙醇,室温进行为了减少人工损伤,需要梯度脱水:30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%,每级15-20分钟,如果是动物样品,脱水时间可5-10分钟,脱水要充分完全地进行直到除尽样品中的水份为止,最后100%乙醇要重复2-3次,保证样品绝对无水。7、置换:醋酸异戊酯30分钟或者过夜样品脱水后,放入醋酸异戊酯中。样品在脱水时,样品中的水份被乙醇脱水剂替代,而乙醇挥发较快易自然干燥,固选用挥发较慢的乙酸异戊酯,既能与CO2溶合,又能与乙醇溶合,作中间媒介液置换。五、实验结果要求学生写出实验报告。SEM常规制样方法(二)——样品的临界点干燥一、实验目的1、掌握样品临界点干燥的目的。2、掌握临界点干燥的操作和原理。二、实验原理我们知道物质有三态:固态、液态和气态。在体积不变的情况下,它们在温度和压力变更下可以相互转化。临界状态,就是在体积恒定状态下,调节CO2的温度即32℃至40℃之间的某一个温度下,液体压强在75个bar以上,液体的CO2的表面张力系数为零。也就是说分子的内聚力等于零,这时物质不能再以液态继续存在,而变成气态,这时气体无论在多大的压强下,都不会变成液体。临界点干燥器也就是利用了将液体CO2加温到临界状态,使CO2汽化过程中的表面张力受到抑制,而在临界状态时不存在液体表面张力的特性,从而消除了样品在干燥中变形的主要因素,达到尽可能使样品保持生活状态的目的。三、实验器