支原体污染后的处理方法.docx

组织细胞培养工作中,可以从以下几方面来预防支原体的污染:
控制环境污染; 严格实验操作; 细胞培养基和器材要保证无菌; 在细胞培养基中加入适量的
抗生素。
当细胞被支原体污染后若由于材料的特殊性必须保留可以采用一定的抗生素进行处理, 对支
原体最有抑制活性抗生素是四环素类、 大环内酯类等。 目前, 市场上已有了新一代支原体抗
生素 M-Plasmocin ,能有效的杀灭支原体,又不影响细胞本身的代谢,而且处理过的细胞不
会重新感染支原体。另外,配合支原体检测试剂盒可以帮助尽快发现支原体的污染。
去医院买一瓶静脉滴注用的”环丙沙星注射液“,国产的很便宜,在超净台内打开,可直接
往培养瓶里加,混匀,终浓度为 10ug/ml ,细胞连续用药两周,即 OK 。也可试 20, 10, 5,
高中低三个浓度,慎重些。本实验室多人试过,效果很好,且一瓶静脉滴注用的”环丙沙星
注射液“,稀释量很大,能用于大量大量的细胞,经济实惠,最穷的人也用的起。
《细胞培养的微生物污染排除》
一、抗生素除菌法:用 BM -1(截耳素衍生物)和 BM -2(四环素衍生物)抑制支原体
:均可用 PBS 配成 250×浓缩液- 20℃备用,使用浓度参考《组织培养和分
子细胞学技术》 117 页表 6- 2。
:取受支原体污染的细胞,吸除培养液,加入含 BM-1 的 1640 培养液培养 3 天后,
吸除培养液,再加入含 BM-2 的 1640 培养液培养 4 天,如此连续三个轮回。
:用 33258 荧光染色镜检(每个轮回末应检测一次) 。
:清除支原体后的细胞,在不加上述抗生素的培养液中,再传代培养 3~ 4 次。
:如清除不彻底可再进行处理至纯净为止(一般 3 个轮回即能被完全消除) 。 BM-1
和 BM-2 与 CIP( 4-氟, 2-羟基喹啉)联合应用亦可,即先用含 BIP 培养液培养 12 天后,再
按上述方法处理。
二、加温除菌法:把受污染的细胞置 41℃中作用 5~ 10 小时。
三、动物体内接种除菌法: 把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中, 借动
物免疫系统消灭支原体, 而肿瘤细胞却能在体内继续生长, 待一定时间后, 从体内取出细胞
再进行培养繁殖。
四、巨噬细胞吞噬法:从动物腹腔采取巨噬细胞,为排除其它细胞成分,可先进行纯化,然
后再加入被支原体污染的细胞培养液中混合培养。 在培养过程中, 为检查支原体是否已被消
除干净,可利用支持物培养法验证, 取出支持物逐日染色、镜检观察, 至支原体已被消除干
净为止。
支原体污染的检测
支原体 (Mycoplasma) 直径在  左右,是一种无细胞壁、具有高度异型性、可以穿过常规
除菌滤膜的最小的原核生物。由于它无细胞壁,故对理化因素 ( 如 65℃下灭活、普通清洁剂
和消毒剂处理 ) 都比较敏感。 支原体依靠附着在宿主细胞表面, 与细胞竞争培养液中的单糖、
氨基酸和核酸前体物质而繁殖生长。
受支原体污染的培养细胞在显微镜下无特殊的外观表现, 培养液也不混浊。 由于对支原体污
染难以观察到特殊的外观变化, 要在污染的早期进行发现和处理是相当困难的。 在细胞培养
过程中, 如果在显微镜