琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制.ppt

琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
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学习动物的处死与组织匀浆的方法。
学习离心机的使用方法。
进一步理解酶的竞争抑制原理。
实验目的:
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实验原理:
竞争性抑制是指分子结构与底物相似的抑制剂可与底物竞争性结合酶的活性中心,抑制酶的活力。竞争性抑制剂的抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比例。
草酸与琥珀酸的分子结构相似,是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。在体内,琥珀酸脱下的2H 经电子传递链传递,最后与氧结合生成水,并释放出能量。在体外则可用甲烯蓝(蓝色)作为受氢体,甲烯蓝接受琥珀酸脱下的2H 而被还原为甲烯白(无色)。在甲烯兰含量一定的条件下,蓝色消退的快慢程度可指示琥珀酸脱氢酶的活力,因此,可依据蓝色消退时间来判断该酶活力被抑制的程度。
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二、实验原理
抑制剂和底物的结构相似,可与底物竞争酶的活性中心,阻碍酶-底物复合物的形成。
酶的竞争性抑制作用
抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑制剂与底物浓度的相对比例([I]/[S])
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HOOC—CH2—CH2—COOH
HOOC—CH=CH—COOH
FAD
FADH2
MBH2甲烯白(无色)
MB甲烯蓝(蓝色)
在无氧条件下,以甲烯蓝褪色时间来判断琥珀酸脱氢酶活性的改变。
草酸
HOOC—COOH
琥珀酸脱氢酶
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实验器材与试剂:
(一)试剂
pH=
%琥珀酸钠溶液
%草酸钠溶液
%甲烯蓝溶液
生理盐水
液体石蜡
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实验器材与试剂:
(二)器材

2mL移液管
1000 uL微量可调仪器
10mL离心管
低速离心机
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实验操作:
(1)肝糜液的制备
用颈椎脱臼法处死小白鼠
将肝脏取出置于研钵,用生理盐水洗净,剪碎肝脏充分研磨至糊状
分批加入磷酸缓冲液,边加边磨,总共7ml
搅匀后倒入圆底离心管,离心3分钟
将上清液倒入一支试管中备用,即为含有琥珀酸脱氢酶的肝糜液
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实验操作:另取中试管5支,标号 琥珀酸脱氢酶活力的测定
编号
1
2
3
4
5
%琥珀酸钠溶液/ml

——



%草酸钠溶液/ml
——




蒸馏水/ml



——
——
肝糜液/ml





甲烯蓝/ml





摇匀,静置于37摄氏度的水浴中(此后再勿摇动)注意观察各管的颜色变化,记录各管颜色消退的顺序和时间,分析原因,振荡褪色的反应液,观察实验现象并分析产生该现象的原因。
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1>肝脏一定要充分研磨至糊状,一使琥珀酸脱氢酶尽量释放到溶液里
2>离心时注意离心管一定要精确平衡,并将重要相等的离心管对称放置
3>离心结束后拿取离心管时动作要轻柔,不要振荡离心管,以免肝糜液重新变浑浊
注意事项:
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