琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制.ppt

琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制制作人:胡森吴启星谢金芳李红丽王婵 1实验目的: ?学习动物的处死与组织匀浆的方法?学习离心机的使用方法?进一步理解酶的竞争性抑制原理 2实验原理: ?竞争性抑制是指分子结构与底物相似的抑制剂可与底物竞争性结合酶的活性中心,抑制酶的活性。竞争性抑制剂的抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及于底物的相对比例。 3 ?草酸与琥珀酸分子结构相似,是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。在体内琥珀酸脱下的 2H 经电子传递链传递,最后与氧结合生成水,并释放能量。在体外则可用甲稀兰作为受 H体,甲稀兰接受琥珀酸脱下的 2H 而被还原为甲白, 由蓝色变为无色。在甲稀兰含量一定的条件下, 蓝色消退的快慢程度可指示琥珀酸脱氢酶的活性,因此,可以依据蓝色消退的时间来判断该酶活性被抑制的程度。 4 ?离心分离的原理: 将处于悬浮状态的细胞,细胞器,病毒和生物大分子等称为“颗粒”,每个颗粒都有一定大小,形状,密度和质量。当离心机转子高速旋转时这些颗粒在介质中发生沉降或漂浮, 它的沉降速度与作用在颗粒上的力的大小和方向有关。 5实验器材与试剂: ?器材: 小白鼠,研钵,手术剪,手术镊子, 2ml 移液管, 10ml 离心管,低速离心机?试剂 磷酸缓冲液 % 琥珀酸钠溶液 % 草酸钠溶液 % 甲稀兰溶液生理盐水 6实验操作?肝糜液的制备: 用颈椎脱臼法处死小白鼠,立即剖腹将肝脏全部取出,用生理盐水洗净肝脏,充分研碎至糊状,然后分批加入少量磷酸缓冲液,边加边磨,总共加入 7ml ,搅拌后离心约 5分钟( 3000rpm ),将上清液倒入另一试管钟备用,此即为含有琥珀酸脱氢酶的肝糜液。 7 另取 5支试管,标号,按下表操作试剂 1号管 2号管 3号管 4号管 5号管 % 琥珀酸钠液( ml) — 2 % 草酸钠溶液( ml)— 2 蒸馏水( ml)22 ——肝糜液( ml )11111 甲稀兰( ml ) 8 ?摇匀, 静置于 37 ℃的水浴中,注意观察各试管的颜色变化。记录各管颜色消退的顺序和时间,并进行分析。 9注意事项: ?肝脏一定要充分研磨至糊状,以使琥珀酸脱氢酶尽量释放到溶液中。?离心时注意离心管一定要精确平衡,并将重量相同的离心管对称放置。(用天平精密平衡离心管和它们的内容物, 若有套筒,离心管应与套筒一起平衡,否则轻者造成离心机损坏,重者会引起人员伤亡)(平衡后应对称放置,不能错位,以免因离心所产生的离心力不对称而损坏离心轴) ?离心结束后拿取离心管时动作要轻柔,不能震荡离心管,以免肝糜液重新变浑浊。?反应开始后,反应液必须静止,不能再摇动。 10