研BI 第8讲 BI与PCR.pptx

评价:* PCR是现今生物生命学科最关注、最爱用、 最欢迎的新技术。* 被誉为:20世纪80年代出现的具有划时代 的、生命学科中革命性的新技术。* PCR使生命学科发生变革,给生物医学的发 展注入无限活力。* 公认PCR最具发展前景,最有生命力的一项 新技术。* 最短时间获诺贝尔奖(86-94年)。* 多么高的评价都不过分。
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每个生物医学工作者都应做到 1)掌握PCR概念与内涵 2)掌握特异性扩增的原理 3)掌握PCR百万倍扩增目的DNA片段原理 4)学会PCR引物的设计,学会PCR操作技术 5)了解PCR的优缺点?应用前景?
PCR (Polymerase Chain Reaction)
聚合酶链反应
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一、问题提出 背景:  分子生物学、遗传学的兴起, 反向生物学的诞生 (核酸、遗传物质,基因型→表型)。 共同障碍: 如何在短时间内快速、获足够量、纯净的、 特异的目的DNA片段/基因供使用,可检测。
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 DNA重组、基因克隆、HGP测序,探针制备  基因工程(基因表达)、基因诊断、基因治 疗,基因预防等给人类带来希望。
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二、PCR的基本概念
概念
由一对引物介导,在体外对特定DNA片段进行
快速、酶促、扩增技术。
简称PCR:聚合酶链反应
DNA扩增、基因扩增、基因富集技术。
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前提:人工合成一对特定引物作向导,
始动DNA合成。
酶促:体外试管内进行酶促生化合成
(非化学合成)。
靶子:特导扩增目的靶序列(目的)。
高效:极微量模板、百万倍扩增
快速:短时高速完成实验。
内涵:
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三、PCR工作原理
PCR的基本原理
变性、复性、半保留复制
PCR过程:3步曲+ 1循环
高温变性 90~97℃
降温退火 45~55℃
适温延伸 72℃左右
反复循环
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分四个阶段讲述其原理:(一)高温模板变性 制备好含有扩增靶序列/目的基因的样品DNA (模板DNA)。然后在高温下(90 - 95℃)使双 键模板DNA变性,解链,获得单链模板DNA,为DNA 合成作好准备。(二)降温引物退火 合成一对特导性引物,在25 - 55℃温度下, 引物与模板配对结合。
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(三)适温引物延伸(适温新链合成) 加入选定的DNA聚合酶,在其适宜温度(Taq 酶为65 - 72℃)进行DNA酶促合成反应,反应体系中的4×dNTP(底物A、C、G、T四种核酸),在引物3′端,在模板序列指导下,开始合成,即引物自5′→3′端延伸,合成一条与模板互补之新链。
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