免疫组化方法和步骤.doc

1基本原理
免疫组化,是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
威斯腾生物 400-675-6758
(1)1×PBS(pH ,= 137mM NaCl+ KCl+ KH2PO4+ Na2HPO4),115℃×15 min;
(2)%NaCl 500 ml= g Nacl+500 ml三蒸水,115 ℃×15 min;
(3)4%多聚甲醛500 ml=20 g多聚甲醛+500 ml PBS在65 ℃水箱中3 h多,再放入4 ℃保存。
(4)DNase I buffer:40 mM Tris-HCl (pH )+10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10 mM CaCl2;
(5)Proteinase K buffer:100 mM Tris-HCl (pH )+50 mM EDTA;
(6)DNase 1(原液1000 U/ml按1:99DNase 1缓冲液稀释至10 U/ml);
(7)DAB工作液(临用前配制,5ul 20×DAB+1ul 30%H2O2+94 ul PBS)
(8)20 μg/ml Proteinase K工作液(按1:500稀释贮存液1 mg/ml)。
(9)另外,双蒸水、%NaCl、二甲苯、梯度乙醇(100、95、85、70、50%)、苏木素。
2主要仪器设备
电热压力蒸汽消毒器(XDD) 浙江绍兴医疗器械总厂
超净工作台苏州净化设备公司
TC2323型CO2恒温孵箱美国SHEL LAB 公司
恒温烤箱上海跃进医疗器械厂
高速台式离心机(BACKMAN CS-15R) 美国Beckman公司
抽滤器( AUTOSCIENCE AP-01) 上海
磁力搅拌器(79-1) 江苏江阴科研器械厂


1/10000电子天枰(Sartorius AC-211) 德国
细胞培养瓶及细胞培养板(Costar) 美国
细胞计数板 上海医用仪器厂
光学显微镜(OLYMPUS CK-40) 日本
倒置显微镜(OLYMPUS) 日本
照像系统(OLYMPUS BH-2) 日本
切片机: 德国Leica
展片机: 德国Leica,HI1210型
烤片机: 德国Leica,HI1220型
3实验方法
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抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响,极易造成脱片。
1. APES:现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中,停留20~30秒钟,取出稍停片刻,再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES,置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位,并尽量减少气泡的存在,以免影响染色结果。
2. Hi