免疫组化方法和步骤.doc

免疫组化检测CD34+的表达1基本原理免疫组化,是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。威斯腾生物400-675-6758(1)1×PBS(,=+++),115℃×15min;(2)%NaCl500ml=+500ml三蒸水,115℃×15min;(3)4%多聚甲醛500ml=20g多聚甲醛+500mlPBS在65℃水箱中3h多,再放入4℃保存。(4)DNaseIbuffer:40mMTris-HCl()+10mMNaCl+6mMMgCl2+10mMCaCl2;(5)ProteinaseKbuffer:100mMTris-HCl()+50mMEDTA;(6)DNase1(原液1000U/ml按1:99DNase1缓冲液稀释至10U/ml);(7)DAB工作液(临用前配制,5ul20×DAB+1ul30%H2O2+94ulPBS)(8)20μg/mlProteinaseK工作液(按1:500稀释贮存液1mg/ml)。(9)另外,双蒸水、%NaCl、二甲苯、梯度乙醇(100、95、85、70、50%)、苏木素。2主要仪器设备电热压力蒸汽消毒器(XDD) 浙江绍兴医疗器械总厂超净工作台 苏州净化设备公司TC2323型CO2恒温孵箱 美国SHELLAB公司 恒温烤箱 上海跃进医疗器械厂高速台式离心机(BACKMANCS-15R) 美国Beckman公司抽滤器(AUTOSCIENCEAP-01) 上海磁力搅拌器(79-1) 德国BM公司1/10000电子天枰(SartoriusAC-211) 德国细胞培养瓶及细胞培养板(Costar) 美国细胞计数板 上海医用仪器厂光学显微镜(OLYMPUSCK-40) 日本倒置显微镜(OLYMPUS) 日本照像系统(OLYMPUSBH-2) 日本切片机:德国Leica展片机:德国Leica,HI1210型烤片机:德国Leica,:抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响,极易造成脱片。:现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中,停留20~30秒钟,取出稍停片刻,再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES,置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位,并尽量减少气泡的存在,以免影响染色结果。:将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中,停留1~2分钟,然后用双蒸水快速清洗三次,室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时,装盒备用。-L-Lysine:将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去