孔雀石绿ELISA-课件·PPT.ppt

隐形孔雀石绿多克隆抗体的制备及鉴定
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汇报时间:
摘自《食品科学》
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实验背景及意义
实验方法及过程
实验结果及分析
个人收获
目录结构
孔雀石绿简介
孔雀石绿(malachite green,MG)
别名中国绿、品绿,属于有毒的三苯甲烷类化学物,既是染料,也是杀菌剂,可用作治理鱼类或鱼卵的寄生虫、真菌或细菌感染,也常用作处理受寄生虫影响的淡水水产。由于孔雀石绿具有高毒素、高残留和致畸、致癌、致突变等副作用,当其进入生物体内,就会快速代谢产生具有更强危害的隐性孔雀石绿(alachite green,LMG)。
2002年5月中国农业部将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》。2005年《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》国家标准要求孔雀石绿在水产品中的检出率不得超过1g/1000t。
多克隆抗体简介
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的,由一种抗原决定簇刺激机体,由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体(Monclone antibody)。
由多种抗原决定簇刺激机体,相应地就产生各种各样的单克隆抗体,这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体,机体内所产生的抗体就是多克隆抗体;除了抗原决定簇的多样性以外,同样一类抗原决定簇,也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。
ELISA技术简介
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay)
ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。本次试验采用的是间接酶联免疫吸附法,示意图如下:
实验方法
Step 1
化学合成法合成隐形孔雀石绿衍生物
Step 2
隐形孔雀石绿衍生物与BSA偶联制备免疫抗原
Step 3
抗原免疫新西兰白兔,获取抗隐形孔雀石绿多克隆抗体
Step 4
特异性抗体效价的测定
实验方法
实验步骤一隐性孔雀石绿衍生物的合成
隐性孔雀石绿的分子结构不具有和蛋白偶联的活性基团,所以合成带有羧基的隐性孔雀石绿衍生物是与载体蛋白偶联的基础。
半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原性,不具免疫原性。如果用化学方法把半抗原与某种纯蛋白的分子(载体)结合,纯蛋白会获得新的免疫原性,并能刺激动物产生相应的抗体。
4-
N,N-
无水乙醇中回流24h(氮气保护)

将混合物溶于40mL甲醇中,
过滤收集淡绿色结晶,用去离子水清洗,真空干燥,重结晶
实验方法
实验步骤二隐性孔雀石绿-BSA全抗原的制备
将前期实验合成的隐性孔雀石绿衍生物用碳化二亚胺法合成免疫抗原隐性孔雀石绿-BSA。
具体步骤如下:
称取8mg %二甲基亚砜的MES缓冲液()中, N-羟基琥珀酰亚胺。
混合物室温搅拌30min,逐滴加入50mL 1mg/mL BSA溶液中。混合物室温搅拌2h, PBS ()透析,去掉未反应物,即制备出隐性孔雀石绿-BSA全抗原。
BSA:牛血清蛋白
碳二亚胺:主要用于活化羧基,使羟基和氨基间脱水形成酰胺键。
PBS:磷酸盐缓冲液,与人体血液等渗,主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠以及氯化钾。
N-羟基琥珀酰亚胺:用于在酰胺键形成时活化羰基基团,减少副产物。
实验方法
实验步骤三抗隐性孔雀石绿多克隆抗体的制备
应用免疫抗原隐性孔雀石绿-BSA,采用常规免疫程序免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。
空白组
背部皮下注射甲试剂 1ml/只
两周后,背部皮下注射乙试剂 1ml/只
两周后,同上
1周后采血制备抗血清,用免疫沉淀实验检测抗体效价。并加强免疫,每次用量均为1mL ,且不加任何佐剂,隔周注射,直到抗体效价不再升高为止。
甲试剂:将制备的完全抗原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化,。
乙试剂:换做弗氏不完全佐剂乳化,其他处理同甲。