牛乳铁蛋白活性肽在发光杆菌中表达及其作用机理研究.pdf

摘要 I
摘要
本论文旨在研究一种新型抗菌肽——牛乳铁蛋白活性肽(bovine lactoferricin-
lactoferrampin,LfcinBA)在发光杆菌中的高效表达及其抗菌作用机理。
为达到此目的,本论文进行了以下几方面的研究:(1)从 5 种发光杆菌菌株
p. luminescens DSM15138、DSM15139、DSM3368、DSM3369 和 DSM12190 中筛
选一种最佳 LfcinBA 表达宿主菌;(2)在此发光杆菌中建立 Red/ET 方法,并应用
此方法敲除发光杆菌中 cipA 和 cipB 基因,获得发光杆菌突变株;(3)采用 Red/ET
方法构建 LfcinBA 融合表达质粒 pBAD-cipB-LfcinBA,实现其在发光杆菌突变株
中的表达;(4)体外抑菌试验检测 LfcinBA 抗菌活性;(5)以 21 日龄断奶仔猪为
动物模型检测 LfcinBA 的抗菌促生长功能,实验选用 60 头 21 日龄健康二元杂(长
白×大约克)断奶去势仔猪(±),按随机处理分为 4 组:对照组(CR),
cipB 对照组(cipB),% LfcinBA 组( LfcinBA),%硫酸粘杆菌素组(CLS),
进行为期 21 天的饲养试验,研究 LfcinBA 对断奶仔猪生长性能、腹泻率、免疫功
能、抗氧化功能、肠道微生物区系以及小肠粘膜组织结构的影响。
研究结果表明:(1)p. luminescens DSM15138 的生长速度、抗性和转化率更
符合作为 LfcinBA 表达宿主菌的要求,因此选择 p. luminescens DSM15138 作为宿
主菌;同时发现,p. luminescens DSM15138 在培养 3h 后,采用缓冲液(10%甘油
+2mm HEPES)制备感受态细胞,在 1100V/cm 电压条件下转化效果较好。(2)在
p. luminescens DSM15138 中建立了 Red/ET 重组方法,并应用此方法敲除了
DSM15138 中两个晶体蛋白基因 cipA 和 cipB,得到 LfcinBA 表达宿主菌命名为 p.
luminescensTZR001。(3)成功构建了 LfcinBA 表达质粒 pBAD-cipB-LfcinBA,并
将其导入 p. luminescens TZR001 中,经诱导表达,SDS-PAGE 电泳检测表明 LfcinBA
表达量占总蛋白量的 20%。(4)体外抑菌试验表明 LfcinBA 对革兰氏阴性菌大肠
杆菌具有极好的抗菌性能。(5)以感染过大肠杆菌的 21 日龄断奶仔猪为动物模型
进行试验表明,与对照组和 cipB 组相比,LfcinBA 显著提高断奶仔猪平均日增重
以及平均日采食量(P<),而与抗生素组相比差异不显著(P>);LfcinBA
组与对照组和 cip 组相比,LfcinBA 组断奶仔猪肠道微生物区系以及肠道形态组织
II 牛乳铁蛋白活性肽在发光杆菌中的表达及其作用机理研究
明显得到改善(P<),而同抗生素组相比,除空肠中大肠杆菌和乳酸杆菌以及
回肠中双歧杆菌数量较低外(P<),LfcinBA 组断奶仔猪肠道中大肠杆菌、乳
酸杆菌和双歧杆菌同抗生素组没有显著差异(P>)。
综上所述,本研究首次在 p. luminescens DSM15138 中建立了 Red/ET重组方法,
成功实现了 LfcinBA 在发光杆菌中的高效表达,LfcinBA 具有较好的抑菌功能,能
够降低腹泻率,改善肠道微生物区系,保护肠粘膜,提高断奶仔猪生长性能和免
疫力。因此,本研究生产的 LfcinBA 可作为抗生素有效替代品添加于饲料中,具
有极好的生态及经济效益。
关键词:重组牛乳铁蛋白活性肽;发光杆菌;Red/ET;早期断奶仔猪;硫酸粘杆
菌素
英文摘要 III
ABSTRACT
Study on Expression of Bovine Lactoferricin-lacteferrampin in Photorhabdus
Luminescens and Its Mechanism of Action
Zhiru Tang (Institute of Subtropical Agriculture, The Chinese Academy of Sciences, Changsha, Hunan 410125)
Directed by Yulong Yin, Youming Zhang and Jianshe Zhang (Insti