细胞生长曲线绘制实验报告.docx

细胞生长曲线绘制实验报告 MTT法测定细胞生长曲线 1、取生长状况良好的细胞,常规消化制成单细胞悬液并计数,调整细胞成六个浓度梯度,依次为:5x10、1x10、2x10、3x10、4x10、5x10/ml,均匀接种细胞于96孔细胞培养板,每孔加细胞悬。液200ul,每个浓度组设6个复孔,共接种7块培养板,37℃、5%C02浓度,饱和湿度培养箱中连续孵育24/48/72/96/120/148/172小时后。 2、每孔加入20ulMTT溶液(smg/m1用PBS配),继续孵育4h后终止培养。 3、快速翻转培养板,弃去上清液,每孔加入150ulDMSO,振荡10min,使MTT蓝紫色结晶完全溶解。 4、用酶联免疫检测仪于490nm处检测各孔的吸光值(OD值),并以未接种细胞只加培养基孔的吸光值为空白对照调零,取6孔平均值。 5、实验重复3次,以培养“时间”为横轴,“吸光值”为纵轴绘制细胞生长曲线。细胞生长曲线的测定 ,用胰酶消化,用新培养基制成细胞悬液后计数(见四、细胞传代培养的实验步骤)。如是非粘壁细胞,则离心弃旧培养基后,换上一定量的新鲜培养基然后制成细胞悬液计数。 ×104/mL作传代培养接种细胞,共接种21瓶细胞。 ,以后每隔24h计数一次,每次取3瓶细胞,分别进行计数。计算平均值。连续计数7d。 ,以单位细胞数(细胞数/mL)为纵坐标,以时间为横坐标绘制生长曲线。(细胞计数方法请参照实验三) (二)细胞生长曲线测定(MTT法)。空白对照以1mL培养基代替细胞悬液。℃孵育4h。使MTT还原为蓝紫色甲月赞结晶。 ,37℃至少静置30min(甚至过液),使甲质颗粒充分溶解。 ,在酶标仪上读取OD值,检测波长570nm,参考波长630nm。 ,每个点为3个平行样品的平均值。细胞裂解液三去污裂解液:50mmol/LTris-cl(pH),150mmol/LNaCl,g/L叠氮钠,1g/LSDS,100mg/LAprotin,10g/LNP-40,5g/L去氧胆酸钠,100mg/L苯甲基磺酰氟(PMSF) 总蛋白抽提程序: 洗细胞3次 ,冰上放置20min ,1XX转,2~10min ,蛋白定量,分装,保存在-78度备用。试剂: %聚丙烯酰胺:29g丙烯酰胺,1gN,N'-亚甲双丙烯酰胺,100ml水,滤膜过滤,棕色瓶,室温保存 %过硫酸铵:1g过硫酸铵,10ml水,4℃保存 %SDS:100gSDS,1000ml水,68℃助溶,pH