实验四蛋白酶活力的测定-精.ppt

实验四蛋白酶活力的测定
(先打开水浴锅,温度设置成40C)
一、实验目的
二、实验原理
三、器材仪器和主要试剂
四、实验操作
五、思考题
六、值日
一、实验目的
掌握定量测定蛋白酶活性的方法,了解本实验的酶、底物和生成物的相关性,以及本反应的环境条件。
进一步理解酶活力和比活力的概念
巩固比色法测定物质含量的基础,掌握分光光度计使用方法,学习绘制标准曲线的方法
二、实验原理
,将酪蛋白水解成酪氨酸等物质。
。酚试剂又名Folin试剂,是磷钨酸和磷钼酸的混合物,在碱性条件下极不稳定,可被酚类化合物还原产生蓝色(钼蓝和钨蓝的混合物,680nm)。
,测定酪氨酸生成量,根据生成物的含量可以计算胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶活力越高,生成的酪氨酸越多。
4. 蛋白酶活力单位定义:在40C,,反应10min,以每min水解酪蛋白产生1 g酪氨酸为1U。
三、器材仪器和主要试剂
可见光分光光度计
水浴锅
Folin –酚试剂
% 酪蛋白
100 g/ml Tyr 溶液
三氯醋酸
Na2CO3
胰蛋白酶
四、实验操作
1、酪氨酸标准曲线的制作
管号
1
2
3
4
5
6
样品、对照滤液(各2支试管)
100g/ml Tyr (ml)
0





每支管加1ml
水(ml)





0
稀释后Tyr浓度(μg/ml)
0
20
40
60
80
100
Na2CO3 (ml)
5
5
5
5
5
5
5
Folin-酚试剂(ml)
1
1
1
1
1
1
1
迅速混合,于40℃放置15分钟
A680nm
调0
A样、A对照
以酪氨酸的浓度(μg/ml)为横坐标, A680nm为纵坐标,作出标准曲线。
管号
酶液(ml)
酪蛋白(ml)
三氯
醋酸(ml)
40℃水
浴准确保温10分钟
三氯
醋酸(ml)
酪蛋白(ml)
40℃水浴保温10分钟,过滤得滤液
样品管
1
2
----
3
-------
对照管
1
----
3
------
2
2、蛋白酶活力的测定
按下表操作,然后测定滤液中的酪氨酸含量。
滤液各取1ml,进行显色反应(加Na2CO35ml+Folin-酚试剂1ml,40 C保温15min)
以标准曲线中的1号管调0,测定A 样(样品液A680nm值)和A 对(对照液A680nm值);
管号
酶液(ml)
酪蛋白(ml)
三氯
醋酸(ml)
40℃水浴准确保温10分钟
三氯
醋酸(ml)