4氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力.doc

蕿氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力蚆芃原理超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基,超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基,从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂(一)材料:植物叶片。(二)仪器设备:高速台式离心机,分光光度计,微量进样器,荧光灯(反应试管处照度为4000lx),试管或指形管数支,黑色硬纸套。(三)试剂(1)()。[]or[():,,按体积9:1混合,,则用KH2PO4或Na2HPO4调节。每1000mL缓冲液含8gNaCl,]肁提取介质:内含1%聚乙烯吡咯烷酮的上述缓冲液。(2)130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液:。(3)750µmol/L氮蓝四唑溶液(NBT):,避光保存。莈(4)100µmol/LEDTA-Na2溶液:-Na2,用磷酸缓冲液定容至1000ml。(5)20µmol/L核黄素溶液:,避光保存,现用现配。三、(视需要定,去叶脉),加2ml预冷的提取介质在冰浴上研磨成浆,加入提取介质冲洗研钵,提取介质终体积为5ml。-2ml于4℃下10000r/min下离心20min,上清液即为SOD粗提液。(要求透明度好)4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下表加入各种溶液:[当样品数量较大时,可在临用前根据用量将表中各试剂(酶和核黄素除外),然后依次加入核黄素和酶液,但终浓度不变。]螆试剂名称蚄用量(mL)螂终浓度(比色时)/µmol/µmol/L羆100µmol/LEDTA-µmol/L羁20µmol/µmol/