氮蓝四唑NBT法测定超氧化物歧化酶SOD活力.docx

氮蓝四唑NBT法测定超氧化物歧化酶SOD活力
氮蓝四唑NBT法测定超氧化物歧化酶SOD活力
氮蓝四唑NBT法测定超氧化物歧化酶SOD活力
氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶活力
一、原理ﻫ超氧化物歧化酶（supｅroxide　disｍutase,ＳOＤ)普遍存在于动､植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基O2-的酶，它催化下列反应：
2O2-+2H+→H2O2+O2
本反应产物H2O2 (NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基,超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在56０ｎm处有最大吸收。而SＯＤ可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小｡
二、材料、仪器设备及试剂
(一）材料
海滨锦葵叶片｡ﻫ(二）仪器设备
高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯(反应试管处照度为4000lx）,试管或指形管数支｡
(三）试剂
（1)0。05ｍoｌ／L磷酸缓冲液（pH7。８）｡ﻫ(2)１30mｍol/Ｌ甲硫氨酸(Meｔ)溶液 称１．939９gMｅｔ用磷酸缓冲液定容至100ml｡
（3)75０µmol/L氮蓝四唑溶液　 称取0．06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100mｌ，避光保存｡ﻫ（４）100µｍoｌ/L　 EDTA－Na２溶液 　称取0．0３7２1g　ＥDＴA-Na2，用磷酸缓冲液定容至１０0０ｍl｡
（5）20　µmol/Ｌ核黄素溶液 称取0。０7５3g核黄素用蒸馏水定容至１000mｌ,避光保存｡
氮蓝四唑NBT法测定超氧化物歧化酶SOD活力
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三、实验步骤
1、酶液提取　　取一定部位的植物叶片(视需要定,去叶脉）0。5ｇ于预冷的研钵中，加１ｍl预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为５ml｡-2ml于４０00r/mｉn下离心１0ｍｉｎ，上清液即为SOD粗提液。
２、显色反应 取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管,另2支为对照管,按下表加入各种溶液:
各溶液显色反应用量：［当样品数量较大时,可在临用前根据用量将表中各试剂(酶和核黄素除外）按比例混合后每支试管一次加入2。65mL，然后依次加入核黄素和酶液，但终浓度不变.]
试剂名称
用量(mＬ）
终浓度(比色时）
／Ｌ磷酸缓冲液

130mｍol/L　 Ｍeｔ溶液
0。３
１3mmol/L
75０µｍｏｌ/L　　NBＴ溶液
0．３
75µmoｌ／L
100µmoｌ/L EDTA—Na2溶液
0。3
１0µｍol/L
20 µmｏｌ/Ｌ核黄素溶液

µmol/L
酶液