氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力.doc

氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力
氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶活力
一、原理
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)普遍存在于动?植物体内,是一种清除超氧阴离
?子自由基??2的酶,它催化下列反应:
?2??2+2??+→H2O2+??2
本反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基,超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基,从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小?
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料
海滨锦葵叶片?
(二)仪器设备
高速台式离心机,分光光度计,微量进样器,荧光灯(反应试管处照度为4000lx),试管或指形管数支?
(三)试剂
(1)()?
(2)130mmol/L甲硫氨酸(Met)?
(3)750μmol/,避光保存?
(4)100μmol/L EDTA- EDTA-Na2,用磷酸缓冲液定容至1000ml?
(5)20 μmol/,避光保存?
三、实验步骤
1、酶液提取取一定部位的植物叶片(视需要定,去叶脉),加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml?-2ml于4000r/min下离心10min,上清液即为SOD粗提液。
2、显色反应取5ml指形管(要求透明度好)4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下表加入各种溶液:
各溶液显色反应用量:[当样品数量较大时,可在临用前根据用量将表中各试剂(酶和核黄
素除外),然后依次加入核黄素和酶液,但终浓度不变。]
试剂名称

130mmol/LMet溶液
750μmol/L NBT溶液
100μmol/LEDTA-Na2溶液
20 μmol/L核黄素溶液
酶液
蒸馏水
总体积用量(mL) 终浓度(比色时) 1