肝糖原的提取、鉴定与定量实验报告.doc

罿薄薈蚅羀膆莇薇薁螅莁袀聿莆羆生物化学实验报告螅螂袅薇膅蚁袄膃芁艿膈蚇羄芀蚄姓名:羁羇螁肄蚁莇学号:葿螆膅膄肂蒂专业年级:膁蒅袁芄蒃螈组别:蚈薇袇莄虿蒅莀芆羁莄肀腿生物化学与分子生物学实验教学中心螈肅莅实验名称蒄蒁芄肝糖原的提取、鉴定与定量蒀肈肁实验日期薃袂薀羈袇肇实验地点蚃芃羃蚀蚆肀合作者螃莀羁膈莅蒅指导老师袃螁肆袀蒈膀评分羃膂膈XX芇膆膇教师签名羃薂螅李某某聿羅芀批改日期肃羃蕿2013-06-03蒇肈罿格式要求:正文请统一用:小四号,宋体,;数字、英文用TimesNewRoman;标题用:四号,黑体,加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。膃肀薄实验目的腿螇莀1、掌握组织样品的制备方法,了解其注意事项。 节蒁羀2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项,掌握其操作方法。 袁薆莆3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。莂袂莃4、熟练运用溶液混匀的各种方法。 荿莅蒀5、正确掌握溶液转移的操作。 蒂莃莁6、正确操作使用分光光度计。肁莈肈实验原理薂蒀莅1、肝糖原的提取与鉴定蕿膇薀糖原储存于细胞内,采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎,低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性,破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质,而糖原仍稳定地保存于上清液中,从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水,故先用95%乙醇将滤液中糖原沉淀,再溶于热水中。薂袁蒇糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中,依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖,利用呈色反应和葡萄糖的还原性,可判定肝组织中糖原的存在。  芀袅薆CuSO4十2NaOH = Na2SO4+Cu(OH)2↓  羆芁膄2Cu(OH)2十C6H12O6 = 2CuOH十氧化型葡萄糖+H2O  蚈羈蚀2CuOH = Cu2O↓(红色)+H2O  肆蚂袈Cu(OH)2= CuO↓(黑色)+H2O蒀蚇芈2、肝糖原定量测定膆肃膇糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖,浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛,此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在(10~100)g范围内,溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色,通过标准对照法(直接比较法)即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定,故在显色之前,肝组织先臵于浓碱中加热,以破坏其它成分,而保留肝糖原。袈蒆芈三、材料与方法:以流程图示意膅膀薃1、材料:薀芅羀(1)样品:鸡肝芅薁芀(2)试剂:95%乙醇、5%(W/V)三氯乙酸、浓盐酸、(50%)NaOH溶液、碘试剂、班氏试剂、(30%)KOH溶液、标准葡萄糖液(50mg/L)、蒽酮显色剂肈芈莇(3)仪器和器材:普通离心机、室温-100℃恒温水浴箱、可见光分光光度计、托盘天平、剪刀、镊子、研钵、试管架、离心管、试管、100mm*15mm试管、刻度吸量管(2ml、5ml)、1000μl微量可调取液器、100ml容量瓶、白瓷反应板莅羂羄2、方法:螀肇蚂(1)肝糖原的提取与鉴定蒅莃罿芇螆莇混匀薅薀莅糖原水解液罿薄膀呈色对比蚅羀螈+50%NaOH5滴莇薇蒇+浓HCL5滴螅莁蒂沸水浴15min,冷却聿莆袂加碘试剂2滴螅螂薇加碘试剂2滴薇膅薇糖原溶液2滴袄膃袃沸水浴2min,溶解沉淀艿膈莀沉淀(弃去)羄芀薀鸡肝约1g,剪碎羁羇蚇+l3COOH1ml肄蚁芄研磨至乳状葿螆肁+l3COOH3ml膄肂荿膁蒅螇研磨成肝匀浆芄蒃蚄全部转入离心管中,离心3min(4000r/min)蚈薇葿上清液(取2ml)莄虿肇离心5min(4000r/min)莀芆袇+2ml95%乙醇,混匀,静置10min莄肀袁沉淀螈肅芁上清液(弃去)蒄蒁袆白瓷板孔穴中蒀肈羇糖原溶液1ml薃袂节糖原水解液2滴羈袇虿+班氏试剂4滴蚃芃衿沸水浴2min,观察变化蚀