哈茨木霉Th-323ThChsC基因的克隆及功能初步分析.pdf

中国农业科学院
硕士学位论文
哈茨木霉Th-323ThChsC基因的克隆及功能初步分析
姓名:冀颖
申请学位级别:硕士
专业:微生物学
指导教师:蒋细良
201105
镄畔⒀Х治黾付≈屎铣擅富云龀鶦序列摘要通过扩增’侧翼序列以及被敲除的序列,筛选得到几丁质合成酶基因傲除突变体哈茨木霉是一类具有生防潜力的丝状真菌,其厚垣孢子制剂为其未来最具潜力的开发方向。厚垣孢子显著特征为细胞壁增厚,而几丁质作为菌丝及孢子细胞壁的主要成分,对维持细胞的结构和功能具有重要作用,其合成关键酶为几丁质合成酶眛蓿.。因此,研究术霉菌几丁质合成酶基因,探索几丁质合成机制,对于研究细胞壁形成过程,进而开发以厚垣孢子为主要成分的木霉菌制剂具有重要意义。本文通过扩增哈茨木霉中的几丁质合成酶基因,构建屎铣擅竿槐涮澹鄄毂硇捅浠醪教骄科涔δ埽峁缦拢寺〖付≈屎铣擅富虻秎鉉片段及其全长将上注册的株丝状真菌几丁质合成酶基冈的序列进行榷裕业奖J匦蛄校源为基础设计简并引物,以哈茨木霉基因组作为模板,进行┰龅玫匠ざ任的序列。在上进行榷裕⑾钟肷昕随咦铀烤的几丁质合成酶基因相似性为%。故在此基础上进行染色体步移,共扩增得至生物信息学比对结果表明登录号嗦肭长为,由鐾庀宰雍个内含子组成,开放阅读框嗦个氨基酸。进行序列比对及同源性分析显示,该基因与串珠状赤霉,.和禾生刺盘孢菌珹付≈屎铣擅富蛳嗨菩宰罡撸直鹞ァィ幌嘤的氨基酸序列同源性均为%,系统进化分析表明属于Ⅲ型几丁质合成酶亚家族。含有鯟峁褂颍峁褂颍琹峁褂颍个跨膜结构域,为膜结合蛋白。预测三维结构表明其含有糖基转移酶的保守峁褂颉菇ḿ付≈屎铣擅富騎槐涮以潮霉素基因作为筛选标记,在其两侧插入的徊嘁硇蛄长度为蚑的嘁硇蛄长度为魑M幢郏徊捎妹盖幸涣臃ǎü菇ǖ闹刈槠斡胨T靥/相连构建打靶载体海篽;采用农杆菌介导转化法将打靶载体导入哈茨木霉一基因组中,根据同源重组原理,使潮霉素基因表达盒替换刀胁驳弥株假定转化子。经过连续五次传代培养后,株仍具有潮霉素抗性,〖付≈屎铣擅富騎贸槐涮;以潮霉素基因为探针,以敲除突变株以及具有表型差异的转化子籰,,,,胍吧突蜃镈为模板,进行分析,检测迦肭榭觥治黾付≈,将菌丝进行染色后,荧光显微镜下观察发现,野生型菌株菌丝内部染色均匀且深,在隔膜处染色更深,而突变体菌丝中染色较浅,说明缺失后,几丁质合成量明显减少。此外,显微观察发现,突变体的菌丝内部径向膨大形成厚垣孢子;分生孢子梗分支减少,长度增长;但生长速度,产色素量,产孢量与野生型没有明显区别。关键词几丁质合成酶,,同源重组,基因敲除,功能分析.。
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英文缩略表英文缩写英文全称中文名称十二烷基磺酸钠乙二胺四乙酸培养基土豆葡萄糖琼脂培养基聚合酶链式反应脱氧核糖核苷酸双蒸水光密度值琼脂糖缬净撼逡每分钟转数氨苄青霉素碱基对开发阅读框根癌农杆菌介导的转化聚乙二醇编码序列/.
、效率高、使用方便,利于大面积施用等优点,因此在农业生产上,化学农药对植物病虫害的防治起着重要作用。但目前,长期不合理使用化学农药导致破坏生态环境、威胁人类生命安全等问题日益凸显,故生物防治将越来越受到人们的重视,尤其是在植物病害防治中拮抗微生物的应用将备受关注詈昕频龋。迄今为止,已发现许多具有生防作用的微生物,木霉菌就是其中一类普遍存在并具有重要经济意义的植物病害生防菌。世纪年代,人们就开始认识到木霉菌对植物病原菌的拮抗作用。研究表明,已被广泛应用于植物生长及储藏期真菌病害防治的拮抗生防菌剂中约肽久褂泄.。A砭莶煌耆臣疲久咕辽俣植≡婢硐洲卓够钚杨依军等,渲幸怨哪久沟氖褂米钗9惴骸4送猓久够咕哂写俳参锷ぁ⒂盏贾参锊病性等方面有作用,因此木霉作为生防菌剂具有广泛的应用前景。世纪年代以来,国内外对木霉菌的拮抗作用及其机制作了许多深入研究拮抗微生物通过代谢活动中分泌的抗菌物质直接对病原物产生抑制作用是其防治植物病害的主要作用方式之一。木霉菌能够产生多种抗菌代谢产物,如哈茨木霉可产生种,康宁木霉⒉种,绿色趺刹值取U庑┛咕镏手饕0括小分子抗生素、多糖、大分子的细胞壁降解酶类或抗菌蛋白。研究表明,木霉菌在侵染真菌细胞肇的过程中起主要作用的酶有,暇厶敲浮⒓付≈拭浮⑾宋孛负偷鞍酌傅徐同等,;柳良好,送饽久咕箍梢圆嘀挚股兀<挠邪⒗顾亍⒙堂顾亍⑦拎5.,M毖芯炕狗⑾郑谝种撇≡墓讨锌咕镏视肫渌酶协同作用的木霉与单独作用的木霉相比,具有更高效的防治效果,竞争作用主要表现在对生存空间、营养等的竞争。