沙田柚花粉管蛋白及花粉同工酶生化分析.pdf

沙田柚花粉管蛋白及花粉同工酶的生化分析
2001 级生态学专业基础生态学方向研究生:李惠敏
导师:秦新民教授

摘要
本研究探讨了沙田柚(Citrus grandis Hort.)花粉离体(in vitro)萌发的优化条件;对
超声波破碎花粉管提取其可溶性蛋白的方法也进行了研究;并且利用了灵敏度高、样品需求量
少的双向电泳结合银染技术,对沙田柚花粉自交、异交条件下离体萌发的花粉管可溶性蛋白的
电泳格局的差异进行了分析;另外,还分析了沙田柚成熟花粉萌发前后三种同工酶(即过氧化
物酶、酯酶、淀粉酶)的类型和活力变化的情况。为沙田柚配子体自交不亲和性在雄蕊方面的
研究提供了一些新的实验证据,并且为最终分离、鉴定沙田柚花粉 S 蛋白打下了基础。
研究结果发现贮藏时花粉的含水量、撒播密度对花粉萌发率和萌发速度的影响至关重要。
所贮藏花药的含水量保持在 ~%范围内,每个加有 培养液的凹面皿(Ø5 ㎝)中,
一般花粉的撒播量为 8~12 个花药,或者每片滴加 培养液的载玻片上,花粉的撒播量为
6~8 个花药;培养温度 28~30℃,这种情况下培养的花粉,其萌发率最高,可达到 80~90%的萌
发率。另外,蔗糖的含量在 10~20%之间条件下,花粉的萌发均较好。其中以 12%蔗糖浓度的
BKS 培养液作为花粉管培养基,花粉不仅有较好的萌发率,花粉管也长得较整齐。
SDS-PAGE 检测利用超声波破碎花粉管提取其可溶性蛋白的效果,结果表明:与常规研磨
法相比,超声波提取法结果稳定、可靠性强、操作简便、大大缩短提取时间。经过比较,以选
用 600W 功率,超声时间 3s/次,间歇时间 6s/次,分三个回合共工作 120 次,每回合之间相隔
10 分钟的组合效果最好。采用这一组参数进行超声波破碎花粉管以提取其可溶性蛋白时,镜检
发现 90%的花粉管断裂成碎片,但花粉粒几乎没有被破碎。
对沙田柚自交、异交条件下花粉管可溶性蛋白的电泳结果进行分析和比较,结果发现,在
SDS-PAGE 单向电泳图谱上检测到自交条件下相对分子量为 和 的两条带不同于
异交条件下蛋白图谱;而异交下条件下出现了分子量为 的差异蛋白。在 IEF-PAGE 的图
谱上,检测到 pI 为 和 的条带为自交花粉管的特异蛋白谱带。对自交、异交条件下的
花粉管可溶性蛋白的 IEF/SDS-PAGE 双向电泳图谱分析也确定了相似于单向电泳上的特异蛋白
带的蛋白斑点。比较分析沙田柚自交、异交花粉管蛋白的双向电泳图谱,两者的蛋白分布格局
相似,具有重叠性,可分辨出 200 多个蛋白点。在已知花柱与自交不亲和有关的蛋白处于的 pI
范围 ~ 之间,考察该范围内自交、异交条件下的蛋白点的变化或差异情况,多次重复
实验的结果发现:在异交花粉管电泳图谱中出现了 1 种特异蛋白(A),A 蛋白(MrA=,
pI=);在自交花粉管电泳图谱中出现了 2 种特异蛋白(B、C),B 蛋白(MrB=,
pI=),C 蛋白(MrC=,pI=),这些蛋白可能是沙田柚花粉管中与自交不亲和有
关的蛋白。鉴于现有的关于配子体型自交不亲和性的两种模型学说,我们的结果从一个方面支
持了“核酸酶抑制剂”模型。
沙田柚花粉萌发前后同工酶变化分析结果显示:萌发前后花粉的过氧化物酶、淀粉酶同工
酶种类变化不大,但萌发后花粉的酶活力比未萌发前高;萌发前后酯酶同工酶类型差异较大,
但均表现较高的酶活性,这说明萌发过程中,代谢活动比较活跃,酶的活性也增强。
关键词:沙田柚;超声波;花粉管蛋白;双向电泳;同工酶
i
The Biochemical Analysis of Pollen Tube Proteins and Pollen
Isoenzymes of Citrus grandis var. Shatinyu Hort.

Abstract
In this study we discussed the better conditions for the pollen culture of Citrus grandis var.
Shatinyu Hort. in vitro and made some research on the method of ultrasonic waves on extracting
proteins from the pollen addition,we e