蛋白酶活性的测定方法.doc

莁蛋白酶活性的测定方法(GB/T23527-2009)腿1 原理蒆蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷钨酸和磷钼酸混合试剂,即福林-酚试剂,碱性条件下极不稳定,易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钨兰和钨兰混合物)。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸),因此,蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋白酶分解酪素(底物)生成含酚基氨基酸的呈色反应,来间接测定蛋白酶的活力。袅2 分析天平: 恒温水浴:精度±℃ pH计: 乳酸缓冲液(pH=)适用于酸性蛋白酶肁甲液:称取乳酸(80%-90%),加水溶解并定容至1000ml。羇乙液:称取乳酸钠(70%)16g,:取甲液8ml,加乙液1ml,摇匀,稀释一倍,。 磷酸缓冲液的制备(pH=)适用于中性蛋白酶葿准确称取磷酸氢二钠()(), 硼酸缓冲液(pH=)适用于碱性蛋白酶膄甲液:,加水溶解并定容至1000ml。膂乙液:,:取甲液500ml,加乙液400ml,摇匀,用水稀释至1L。 :, :, : ,,(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿,,加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100ml容量瓶中,用适宜的缓冲液稀释至刻度,此溶液在冰箱内贮存, 100μg/℃干燥至恒重的L-,用1mol/L的盐酸60ml溶解后定容至100ml,.,,- ,用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上清液倒入100ml容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。。荿4 标准曲线的绘制蒁L-酪氨酸标准溶液按下表配制。薀试管号膈0蚄1袂2节3袇4羇5芃取100μg/ml酪氨溶液(ml)螀0羀1肇2蚄3蒂4蝿5膇蒸馏水(ml)肅10袀9蒈8芇765酪氨酸实际浓度(μg/ml)010