细胞支原体污染的荧光检测方法配图.doc

细胞支原体污染的荧光检测方法[配图]DNA萤光染色法·  原理︰利用萤光染剂(bisbenzimide,Hoechst33258)侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine(A-T)rich区域,因为支原体之DNA中A-T含量占多数(55~80%),所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后,在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点,即为支原体之DNA,证明有支原体之污染。·  测试步骤用间接步骤,将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中(indicatorcell,例如Verocellor3T6cell),然后培养指示细胞再作萤光染色。正负反应对照组亦可以接种于indicatorcell内作为对照。·  待测细胞亦可作直接测试,但需为吸附型细胞,培养后直接作萤光染色。有些细胞易有萤光背景,而干扰结果判读,则建议使用接种于指示细胞之步骤。·  特点︰简单、经济与灵敏,广泛使用,可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体,,较直接培养法快,约一星期即可知道结果。·  缺点:有时仍会有萤光背景,影响判读。材料︰·  Hanks’balancedsaltsolutionwithoutNaHCO3orphenolred(HBSS,GibcoBRL21250-014﹚、bisbenzimide(,SigmaB-2883)、thimerosol(SigmaT-5125)、、02Mdisodiumphosphate、glycerol、glacialaceticacid、methanol、strerileH2O、chamberslide(Nunc177380)或chamberslide替代物:35or60mmsterileplate内放置无菌22x22mm盖玻片﹙浸于酒精内,使用前过火灭菌﹚,一般吸附型细胞均能吸附在盖玻片上。染色后取出盖玻片,细胞面朝下放在玻片上观察。·  Indicatorcells:Vero(Africangreenmonkeykidney,L-RC60013)or3T6(mousefibroblast,L-RC60070),细胞须先测试无污染。αMEMwith10%FBS(mediumforVerocell)配制试剂:·  无菌HBSS︰配制Hanks’balancedsaltsolution,。勿用高压蒸汽灭菌。·  Hoechst33258stocksolution(100X)︰,置于棕色瓶中,室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后,,贮存于-20℃。·  Hoechst33258workingreagent︰取1mlHoechst33258stocksolution,加入sterile100mlHBSS中,室温下搅拌45分钟,置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆,避免光照,贮存于4℃。·  mountingsolution︰,以1