细胞支原体污染的荧光检测方法配图.doc

细胞支原体污染的荧光检测方法[配图]
DNA萤光染色法
·  原理︰利用萤光染剂(bisbenzimide, Hoechst 33258)侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域,因为支原体之DNA中A-T含量占多数(55~80%),所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后,在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点,即为支原体之DNA,证明有支原体之污染。
·  测试步骤用间接步骤,将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中(indicator cell,例如Vero cell or 3T6 cell),然后培养指示细胞再作萤光染色。正负反应对照组亦可以接种于indicator cell内作为对照。
·  待测细胞亦可作直接测试,但需为吸附型细胞,培养后直接作萤光染色。有些细胞易有萤光背景,而干扰结果判读,则建议使用接种于指示细胞之步骤。
·  特点︰简单、经济与灵敏,广泛使用,可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体,例如M. hyorhinis,较直接培养法快,约一星期即可知道结果。
·  缺点:有时仍会有萤光背景,影响判读。
材料︰
·  Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014﹚、bisbenzimide (Hoechst , Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、 citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物:35 or 60mm sterile plate内放置无菌22x22mm盖玻片﹙浸于酒精内,使用前过火灭菌﹚,一般吸附型细胞均能吸附在盖玻片上。染色后取出盖玻片,细胞面朝下放在玻片上观察。
·  Indicator cells: Vero (African green monkey kidney, L-81 RC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, L-96 RC 60070),细胞须先测试无污染。αMEM with 10%FBS ( medium for Vero cell)
配制试剂:
·  无菌HBSS︰配制Hanks’ balanced salt solution,。勿用高压蒸汽灭菌。
·  Hoechst 33258 stock solution(100X)︰ mg mg thimersol溶于100 ml无菌HBSS,置于棕色瓶中,室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后,,贮存于-20℃。
·  Hoechst 33258 working reagent︰取1 ml Hoechst 33258 stock solution,加入sterile 100 ml H