细胞支原体污染的PCR检测.doc

细胞支原体污染的PCR检测
支原体菌株来源：
       ATCC23838 精氨酸支原体
      
      ，避免可能之污染。 
缺点：PCR反应很灵敏，易有伪阳性结果。此方法尚在评估中，故结果仅作为参考和内部品管之一部份。 
材料与设备： 
      ATCC mycoplasma detection kit:可作50～100 reactions. 
      提供1st stage primer mixture与2nd stage primer mixture 
      positive control DNA (A. laidlawii ; M. pirum) 
      PCR reagents : 
      Taq polymerase ( 5 U / ul ) 
      dNTP( dGTP, dCTP, dTTP, dATP,  mM each ) 
      10x PCR buffer (with  MgCl2) 
      25mM MgCl2 
      sterile ddH2O 
      Machine / Equipment： 
      PCR thermal cycler 
      agarose电泳设备 
      DNA电泳胶体观察设备 
      无菌PCR反应管 
       ml微量离心管 
      无菌2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans 
方法： 此PCR反应是一种nested PCR，包括2阶段PCR反应，1st stage PCR结束后，取其反应物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有无及片段大小来分析结果。 
结果：使用UV light观察，并照相记录。 
不过应用较多还是巢式PCR 
方法：此PCR反应是一种nested PCR，包括2阶段PCR反应，1st stage PCR结束后，取其反应物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有无及片段大小来分析结果。 
结果：使用UV light观察，并照相记录。 
方法再详尽点：1st stage PCR reaction（total volume 25 ul）： 
       测试样品 ( 2 ul / each ) 
       直接取样测试细胞之培养液。 
       Positive control : mycoplasma DNA ( A. laidlawii ; M. pirum ) 
       Negative control : ddH2O 
       Reaction mixture ( 23 ul / each )