实验9redet同源重组.ppt

Red/ET同源重组技术
2015年3月25日
内容
一、什么是Red/ET同源重组
二、技术的特点
三、作用机制
四、功能元件
五、操作流程及关键因素
六、在基因工程中的主要应用
七、新技术的发展
八、在其他细菌中的应用
遗传重组
基因组的可变性和稳定性之间必须维持一个恰到好处的平衡,这样才能使生物体得以生存并能世代相传,繁衍不息。
染色体的遗传差异主要由两种机制产生,一种是突变,一种是遗传重组。
◘重组可分为四类(DNA序列、蛋白质因子)
◘狭义遗传重组:涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流
◘遗传重组与重组DNA技术
异常
广义遗传重组:任何造成基因型变化的基因交流过程
一、什么是Red/ET同源重组
1. 概念
Red/ET重组是新近出现的一种利用来自E. coli中λ噬菌体的重组酶Redα/Redβ或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE/RecT 进行基因同源重组的DNA工程技术。
2. 原理
首先重组酶沿5’→3’方向消化双链DNA,露出粘性末端(15-50bp)。随后重组酶介导单链退火修复(single- strand annealing),即载体和插入片段的黏性末端(15-50bp) 互补形成稳定的带缺刻的环状重组质粒,转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒
3. 特点:
Red同源重组技术具有同源序列短(15~50bp)、重组效率高、操作简单、快速的特点。
4. 应用
这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行,大大推动功能基因组研究的发展。
g b a
l phage
ET
Rac phage
Rac recE/recT 操纵子= λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶(Redα/Redβ或者RecE/RecT)协同配合完成重组作用;
recE = red α:5’→3’ dsDNA核酸外切酶;
recT = redβ:ssDNA结合和退火蛋白;
redγ: 防止 E. coli中的核酸酶 RecBCD对外源线性DNA片段的消化。
λ噬菌体的pL操纵子示意图
Reda(RecE)
Red同源重组原理示意图
Single-strand
annealing
Strand
invasion
3’
5’
Digestion
Binding
3’
5’
Redb(RecT)
Repair/Replication
Selection
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异
“线状DNA+线状DNA”重组,选用RecE/RecT重组酶系统;
“线状DNA+环状DNA”重组,选用Redα/Redβ重组酶系统;
根据需要选择含不同抗生素抗性基因(Ampr、Hygr、Tetr)和不同的诱导型启动子(pBAD、pTet)的重组酶系统表达质粒。
质粒:
pSC101-BAD-gbaA(amp)
pSC101-BAD-gbaA(tet)
pSC101-BAD-gbaA(hyg)
pSC101-Tet-gbaA(tet)
pSC101-BAD-ETgA(tet)
pSC101-Tet-ETgA (amp)