ELISA法检测幽门螺杆菌抗体.doc

ELISA法检测幽门螺杆菌抗体1983年Warren和Marshall从人胃粘膜成功地分离出幽门螺杆菌(Hp)之后,Hp与胃炎、消化性溃疡的相关性引起人们极的兴趣人们推测其可能成类疾病的致病因素之。许研究者正进一步探索其致病机理,并从不同角度寻找快速、可靠的检测方法。迄今为止,检测Hp的方法包括组织标本培养,切片染1314色,细菌直接涂片染色,快速尿素酶测定及C尿素呼吸试验和C尿素呼吸试验等。除尿素呼吸试验外其余方法均需通过胃镜检查才能完成,鉴于取材困难,进一步寻找检测Hp感染的免疫学方不进非常必要的。国外有人用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测临床病人血清中有Hp抗体报道,国内尚未有这方面研究报告。本文报道建立一检测人体抗Hp抗体的ELISA的实验结果及与细菌培养法和尿素酶测定法对比检测结果,研究证明本法特异、敏感、适用于大量标本普查和及时判断治疗反应,现将结果报告如下。?40孔聚苯乙烯微量凹孔板:上海塑料三厂产品。?酶联板离心篮:根据40孔酶联板本实验室自行设计制成。?DG—?型酶联免疫检测仪:南京华东电子管厂产品。?试剂:过氧化物酶(HRP),R2=,美国Sigma公司产品。邻苯二胺(OPD):上海白鹤化工厂产品,按文献配制。包被液:,蒸馏水1000ml配成。洗涤液:以上未加吐温—20的洗涤液100ml+2%小牛血清+4%聚乙二醇(PEG)。封板液:5%小牛血清。戊二醛固定液:25%戊二醛液,100ml装,Kochligh进口分装,%戊二醛固定液。终止液:2NHSO。?抗原的制备:将澳大利亚皇家佩思医院的Hp24标准菌株(NCTC11638)及从胃镜检查患者胃粘膜活检标本分离出的Hp菌株分别接种于心脑血平板,37?培养5d后取菌落作生化与血清学鉴定(自制兔抗Hp抗体),然后取单菌落移种于另一血平板,继续培养3d,经鉴定后将其大量增殖培养,3d后将菌苔刮下,置生理盐水中制成菌液,加福尔马林固定(%~%),4?过夜,3000r/nin离心30min,沉淀3次,将最后1次沉淀悬于少量PBS液内,用比浊管没出细菌浓度,制成含菌3×109ml,置冰箱冰冻,反复冻融3次,经显微镜检查无菌体存在后,制成可溶性抗原,采用Lowry氏法蛋白定量,-20?保存备用。?临床血清标本:采自胃镜检查患者,随机采取1988年8~10月胃镜检查病人共38人,抽静脉血2ml,分离血清贮存-20?备用。?阴性对照血清,进行ELISA测定,取其平均OD值作对照。?酶标羊抗人IgG结合物(SAHIgG—HRP)的制备:按过碘酸盐改良法,略加改进标记制成酶标抗体。,22?较搅20min。加乙二醇6滴,继续搅拌5min,,(用2molHC1调pH)透析过夜,中间换水4次,加羊抗人IgG(上海生物制品研究所产品)14mg,逐滴加pH,,~,室温较搅2h,加硼氢化钠(4mg/ml),置4?2h,,-?透析平衡。换水4次,收取透析袋内结合物,以50%饱和度硫酸铵溶液盐析去除游离酶后,测定精制结合物,E/P克分子比值合格后,