小鼠骨髓细胞微核试验.ppt

1 1 目的目的??通过本次实验,学习和掌握小鼠骨髓多染通过本次实验,学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞(红细胞(PCEPCE)微核测定方法。)微核测定方法。??2 2 原理原理微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规规律地进入子细胞形成细胞核时,仍然留律地进入子细胞形成细胞核时,仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环。它在末期以后,单独形成一粒断片或环。它在末期以后,单独形成一个或几个规则的次核,被包含在细胞的胞个或几个规则的次核,被包含在细胞的胞质内而形成,由于比核小得多故称微核。质内而形成,由于比核小得多故称微核。微核成因微核成因化学致突变物化学致突变物染色体作用于纺锤丝无着丝点,片或环整条染色体带着丝粒的环和断片于细胞分裂末期细胞质中形成微核小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成因此,微核试验用于检测断裂剂和部分非整因此,微核试验用于检测断裂剂和部分非整倍体致突变剂。倍体致突变剂。微核可出现在多种细胞中,但在有核细微核可出现在多种细胞中,但在有核细胞胞中较难与正常核的分支相区别,由于红中较难与正常核的分支相区别,由于红细胞在成熟前最后一次分离后数小时可将细胞在成熟前最后一次分离后数小时可将主核排出,而仍保留微核于主核排出,而仍保留微核于PCEPCE细胞中,因细胞中,因此,通常计数此,通常计数PCEPCE细胞中的微核数。细胞中的微核数。3 3 器材与试剂器材与试剂?? 器材器材解剖器械,生物显微镜,载玻片解剖器械,生物显微镜,载玻片等。等。?? 试剂试剂甲醇(分析纯)、甘油(分析甲醇(分析纯)、甘油(分析纯)、小牛血清、生理盐水、纯)、小牛血清、生理盐水、GiemsaGiemsa储备储备液、液、pH ?? 阳性对照物阳性对照物环磷酰胺环磷酰胺4 4 操作步骤操作步骤?? 试验动物及处理试验动物及处理??动物选择动物选择??小鼠是微核试验的常规动物,通常用小鼠是微核试验的常规动物,通常用77~~1212周龄,体重周龄,体重1818~~20g20g的小鼠。每组的小鼠。每组1010只,雌只,雌雄各半。雄各半。??剂量及分组剂量及分组??受试物应至少设三个剂量组,最高剂量组受试物应至少设三个剂量组,最高剂量组原则上为不产生动物死亡的最大毒作用剂原则上为不产生动物死亡的最大毒作用剂量。一般取受试样品量。一般取受试样品1/51/5、、1/101/10、、1/20 LD50 1/20 LD50 剂量。剂量。??另设溶剂对照组和阳性对照组。阳性对照另设溶剂对照组和阳性对照组。阳性对照组可用环磷酰胺腹腔注射组可用环磷酰胺腹腔注射11次。阴性对照组次。阴性对照组使用等体积的溶剂。使用等体积的溶剂。??染毒途径染毒途径腹腔注射腹腔注射??染毒次数及取样时间染毒次数及取样时间??一般采用两次或多次染毒。两次染毒:第一般采用两次或多次染毒。两次染毒:第一次染毒后一次染毒后2424小时进行第二次染毒,小时进行第二次染毒,66小时小时后取样;多次染毒:每天染毒后取样;多次染毒:每天染毒11次,连续次,连续55天,末次染毒后天,末次染毒后2424小时取样。小时取样。?? 骨髓液的制备和涂片骨髓液的制备和涂片??试验动物一次染毒后,按确定的时间用颈试验动物一次染毒后,按确定的时间用颈椎脱臼或麻醉法将其处死,取胸骨,擦净椎脱臼或麻醉法将其处死,取胸骨,擦净血污,剔去肌肉,剪去骨骺,用小型止血血污,剔去肌肉,剪去骨骺,用小型止血钳将骨髓挤于有一小滴小牛血清的清洁载钳将骨髓挤于有一小滴小牛血清的清洁载玻片上,混合均匀后推片。也可在股骨取玻片上,混合均匀后推片。也可在股骨取骨髓。骨髓。??阳性及阴性对照组处理方法同上。阳性及阴性对照组处理方法同上。