小鼠骨髓细胞微核试验.doc

小鼠骨髓细胞微核试验
一、目的
主要通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞(PCE)的微核出现率,间接反映骨髓细胞染色体畸变发生率的高低,从而判断受试动物是否具有致突变作用。主要用于测试干扰细胞有丝分裂的物质。
二、原理
微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒,大小相当于细胞直径的1/20~1/5,呈圆形或杏仁状,其染色与细胞核一致在间期细胞中可以出现一个或多个。一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。所以微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。
微核可以出现在多种细胞中,但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出,而仍保留微核于PCE细胞中,因此通常计数PCE细胞中微核。
三、器材与试剂
(一)、器材
手术刀、手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、干净纱布,带橡皮头吸管、台式离心机、刻度离心管、晾片架、电吹风机、玻璃染色缸、2ml注射器及针头、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微镜细胞计数器。
(二)试剂
甲醇(分析纯)、甘油(分析纯)、小牛血清、生理盐水。
1、吉姆萨(Giemsa) 贮备液取Giemsa染料1g,甘油66ml,甲醇60ml。先将染料置于研钵内,加入小量甘油混合研细,置60°C水浴2h,取出待冷却后加入甲醇,混合静置2周后,过滤于棕色瓶内,存放阴凉处。该贮备液存放的时间越长,染色效果越好。%的应用液。
2、磷酸盐缓冲液
(1)甲液——1/15mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)称取无水Na2HPO4 ;含2、7和12份结晶水时,、 g .
(2)乙液——1/15mol/L磷酸二氢钾(KH2PO4)称取KH2PO4 。
,取为配制吉姆萨染液和吖啶橙染液,需配制3种磷酸盐缓冲液:○
,甲液20ml和乙液80ml混合即可;○取甲液 30ml和乙液 70ml混合即
,取甲液 。可;○
各种pH的磷酸缓冲液配成后,可用 pH 计加以校准,调节至所需的pH。
3、吖啶橙染液
(1)%吖啶橙水溶液作为贮备液。。置褐色瓶内,在4°C下可保存数周。
(2),临用时配制。%吖啶橙贮备液,30份1/15mol/。
四、操作步骤
1. 动物一般选用7~12周的、体重20~30g的小鼠,也可选用体重150~200g的大鼠。每个剂量组至少用两种性别的动物各5只。若需多次采样,则每组的动物数需增加,每个采样时间至少有8只动物。
2. 剂量及分组根据受试物的理化性质(尤其是溶解度、水溶性或脂溶性),确定溶剂。
一般采用水或食用植物油,