抗青霉素单克隆抗体.doc

抗青霉素单克隆抗体的制备及检测摘要:将半抗原青霉素和载体蛋白偶联后免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术建立稳定分泌抗青霉素mAb的杂交瘤细胞株。常规制备腹水,用辛酸硫酸铵法纯化,并对纯化的mAb进行特异性鉴定,成功地制备了抗青霉素的mAb。青霉素因其高效、低毒的特点在临床上被广泛应用,但其结构中的β内酰胺环很不稳定,在溶液状态尤其是碱性条件下易开环与蛋白、多肽的氨基发生亲核反应生成稳定的青霉噻唑蛋白,形成临床主要的过敏原。青霉素类抗生素的过敏反应发生率居各种药物之首[1],[2]。生理条件下青霉素开环后大约95%与蛋白质共价结合形成青霉噻唑基(benzylpenicilloyl,BPO)主要抗原决定簇。理论上连接有两个青霉噻唑基的蛋白、多肽就可能与IgE分子形成桥式结构从而引发I型超敏反应。青霉素的这种不稳定性使得在制备过程中添加有青霉素的生物制品以及食品中都可能残留有青霉噻唑蛋白,而目前的检测方法通常是针对游离的有抗菌活性的青霉素,尚无专门针对具有免疫原性且有潜在致敏危险的青霉噻唑蛋白的检测方法。功能:采用杂交瘤技术制备了稳定分泌抗青霉素mAb的杂交瘤细胞,产生的抗体对青霉噻唑蛋白特异性强、灵敏度高,有望对药品、食品中可能残留的青霉噻唑蛋白进行痕量检测。1材料和方法[3],相对分子质量(Mr),%;牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、多聚赖氨酸(PolyLLysine,PLL);DMEM培养液,新生牛血清;HAT、HT、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、Ig亚类试剂盒,聚乙二醇(PEG)4000,BCA蛋白浓度测定试剂盒。小鼠骨髓瘤细胞,BALB/c雌鼠(6~8周龄)。①免疫原的制备:,充分混匀后加入5mg牛血清白蛋白BSA(或卵清蛋白OA),调节pH值至11,37℃搅拌过夜,。将透析物分装于-20℃保存。②筛选用包被抗原的制备:用直链结构的多聚赖氨酸(PolyLLysine,PLL)与青霉素偶联成BPOPLL,方法同①。,每只20μg,皮下多点及四脚掌初次免疫;14d后相同剂量腹腔加强免疫,每2周加强1次,加强后每隔7d眼眶采血,分别测定针对半抗原和载体蛋白的抗体效价,于细胞融合前3d尾静脉加强免疫。、筛选及克隆按照常规法PEG融合[4]。分别用BPOPLL、PLL作为包被抗原和对照抗原(均为1mg/L包被)、工作浓度兔抗鼠二抗,用间接ELISA检测上清液。以免疫小鼠的血清为阳性对照,以Sp2/0细胞培养的上清液为空白对照,以细胞培养板中未长出克隆的细胞培养液上清为阴性对照,选取P/N值最高的采用有限稀释法进行3或4次克隆。每次克隆后,对扩大培养建库的细胞上清再分别用阴性对照PLL、BSA、OA和检测用抗原BPOPLL、BPOBSA、BPOOA包被,间接ELISA检测。。经还原SDSPAGE电泳检测纯度,BCA试剂